水动力肾盂注射：一种将DNA直接递送至小鼠模型肾细胞的技术

摘要

来源：Woodard, L. E. 等. 通过水动力肾盂注射实现肾脏中蛋白质的非病毒表达。J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们介绍了将质粒通过水动力注射法导入小鼠肾脏肾盂以实现核酸转染的实验方案。该技术利用高静水压的原理，可在不造成组织损伤的情况下，将质粒强制导入特定器官部位，实现器官特异性的质粒递送。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 进行水动力肾盂注射手术

1. 谨慎选择用于手术的小鼠。
   注意：目前尚未观察到品系特异性差异，但可能存在。大多数注射操作均在 C57BL/6 或 FVB 背景小鼠上进行。肾盂注射在 6–12 周龄的小鼠中效果最佳。在大于 16 周龄的小鼠中，由于不明原因，荧光素酶成像显示失败率可能高达 50%。类似的年龄相关失败率也见于尾静脉水动力注射肝脏实验，因此这可能是与水动力注射原理相关的一般性限制。同理，已有研究显示，在纤维化大鼠肝脏中进行尾静脉水动力注射的效果不如健康肝脏，因此在肾纤维化情况下，肾盂水动力注射的效果也可能降低，但此推测尚未得到直接验证。

2. 准备小鼠和DNA注射器以进行手术

1. 使用氯胺酮和赛拉嗪麻醉小鼠。
   1. 穿戴动物实验设施要求的正确个人防护装备，例如一次性实验服、外科口罩和丁腈手套。
   2. 每次处理2–4只小鼠，将每只小鼠放入500 mL塑料烧杯中，使用精确至0.1 g的天平称重。根据每只小鼠的体重，计算需通过腹腔注射给予的麻醉剂用量，即用生理盐水（0.9%）稀释后的24 mg/mL氯胺酮和2 mg/mL赛拉嗪混合液（有关腹腔注射的更多操作，请参见参考视频）。使用公式（50 μL + (5 μL) × 体重(g)）进行计算，或在与当地兽医团队及实验动物护理与使用委员会（IACUC）协商后，采用其他公式计算。
   3. 采用标准技术进行腹腔注射。将小鼠置于纸桶中，直至其不再活动。
      注意：当小鼠对脚趾夹捏测试无反应时，表明已准备好进行手术。若小鼠在初次注射后20–30分钟仍对脚趾夹捏有反应，则应根据反应强度追加20–60 μL麻醉剂。
   4. 将小鼠置于循环水加热垫上，加热垫表面覆盖蓝色垫布，并在双眼内涂抹兽用眼膏，以防止角膜干燥。
2. 使用专为宠物美容设计的剃毛器，剃除小鼠背部左侧从肩部到臀部、侧腹至脊柱区域的毛发，并清除松散的毛发和碎屑。
3. 为每只麻醉后的小鼠准备一支独立的注射器，内含100 μL稀释后的DNA溶液，确保无气泡。
   1. 使用无安全装置、针头永久固定的无菌29G × ½" 0.5 mL U-100胰岛素注射器。
      注意：注射器类型至关重要。该规格可实现快速注射；针头永久固定可防止溶液泄漏；安全装置的存在会妨碍进入肾盂。根据材料表中指定的注射器在注射过程中比其他测试品牌更顺畅均匀。
   2. 将注射器吸取至约120 μL，然后回拉活塞在顶部留出空间。用笔轻敲注射器，使所有气泡上升至顶部。针尖朝上，小心下压活塞，排出所有空气，直至针尖出现液滴。注射器内不得残留任何可见气泡，否则可能导致空气栓塞，造成动物死亡。
   3. 继续下压活塞，将注射器内液体精确调整至100 μL，多余DNA溶液排回原始微量离心管中。如有需要，请仔细标记，并将装好液体的注射器放置于无菌敷布上以维持无菌状态，特别是在操作场所不允许针头重新套帽的情况下。

3. 进行注射手术

1. 准备手术场地。将无菌敷布覆盖在加热垫上，并将无菌手术器械取出后放置于无菌敷布上，避免触碰。拿起小鼠并将其置于视野范围内。调整光源以照亮操作区域。
2. 从包装中取出三根含3.15%葡萄糖酸氯己定和70%异丙醇的皮肤消毒棉签，并放置在动物附近。
3. 更换为无菌外科手套。以切口部位为中心，采用环形方式，使用新的氯己定/酒精棉签对动物皮肤进行三次擦拭消毒。
4. 根据图1A所示定位切口位置。用镊子夹起皮肤，使用剪刀在距离脊柱约1 cm、肋骨下方处切开皮肤层。当切口长度达到约1 cm后，在肌肉层下方做一相似切口。
   注意：切口长度应适中，使肾脏刚好能够略微突出切口，并由切口本身固定其位置。切口过小则无法暴露肾脏；切口过大则肾脏会持续滑回腹腔。
5. 定位肾脏。
   注意：肾脏可能隐藏于白色脂肪组织中。脾脏也位于动物左侧，两者颜色可区分：脾脏呈深紫红色，而肾脏呈深红橙色。应避免操作脾脏，因其容易破裂。
6. 在不接触肾脏的前提下，用手指对腹部施加稳定而轻柔的压力，将肾脏从腹腔中轻轻推出（见图2C）。如有必要，使用闭合的镊子将其他非目标器官轻轻推回腹腔。切勿使用张开的镊子，以免损伤肾脏或其他器官。
7. 当肾脏完全移出腹腔后，轻轻分离其周围脂肪组织，直至可观察到肾盂——一个微小的白色斑点（见图1B）。将多余脂肪推向一侧或必要时予以清除。注意不要切除位于肾脏上极附近的肾上腺或肾脏包膜。
8. 用闭合的镊子轻压肾脏右侧，以保持肾盂视野清晰，右手持装有溶液的胰岛素注射器，使其与操作台面平行，针尖对准肾盂（见图2E）。如图1B所示，小心地将针头插入固定住的肾脏肾盂内。
9. 在三秒内快速注射溶液。约三分之一的肾脏区域可能出现颜色变浅，转为白色。
   注意：注射后常可见肾脏包膜下液体积聚以及血肿形成。一定程度的组织损伤是实现可检测水平DNA转染所必需的。
10. 保持针头原位约10秒，以防止溶液回流。随后小心缓慢拔出针头。通过轻柔牵拉切口并使用闭合镊子，将器官复位至腹腔内。
11. 使用5-0可吸收缝线缝合肌肉层，打2–4个独立结。
12. 使用5-0或6-0不可吸收尼龙缝线缝合皮肤层，打2–4个独立结。
    注意：手术器械可在无菌玻璃珠浴中灭菌并冷却后重复使用。

结果

图 1. 水动力肾盂注射的正确切口位置和针头放置。A) 切口（红线）应位于小鼠脊柱约 1 cm 处，并在肋骨下方约 1 cm 处。 B) 通过侧腹切口暴露肾脏后，肾盂应位于肾脏中段，呈微黄透明/白色小点。注射时应避免扰动肾静脉、肾动脉或输尿管。胰岛素注射器的针头如图所示直接插入肾盂，深度约为 0.5 cm，并在 2–3 秒内快速推注。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AnaSed 赛拉嗪	帕特森兽医公司	07-808-1947	麻醉剂 - 非管制物质
BD 胰岛素注射器 0.5 mL 29G 1/2 英寸 	卡地纳健康公司 	309306	所需注射器
Buprenex 	药剂师/兽医 		镇痛剂 - 管制药品
超精细显微解剖剪 	罗博兹外科器械公司 	RS-5882 	外科工具
Gaymar 加热泵 	帕拉贡医疗公司 	TP-700 	循环水加热泵
Germinator 500 	罗博兹外科器械公司 	DS-401 	用于手术过程中重复使用外科器械
Graefe 镊子 	罗博兹外科器械公司 	RS-5136 	外科工具
Graefe 组织镊 	罗博兹外科器械公司 	RS-5153 	外科工具
Halsey 持针器，5" 长度 	罗博兹外科器械公司 	RS-7841 	外科工具
加热垫 - 15" x 21" - 至少需要3个 	帕拉贡医疗公司 	TP22G 	与 Gaymar 加热泵配合使用
氯胺酮 	药剂师/兽医 		麻醉剂 - 管制药品
Prevantics 消毒棉片 	赛默飞世尔科技公司 	23-100-110 	用于皮肤手术准备
Prolene 5-0 缝线 锥形针 30" 	赛默飞世尔科技公司 	NC0256891	皮肤用不可吸收缝线
Puralube 品牌眼用软膏 	帕特森兽医公司 	07-888-2572	用于保持手术期间眼睛湿润
Vicryl 5-0 缝线 J303H 	赛默飞世尔科技公司 	NC9816710 	肌肉层用可吸收缝线
Wahl Mini Arco 电推剪	Med-Vet 国际公司	I 8787-1550	用于皮肤准备的剃毛器