建立肾细胞癌模型：通过癌细胞肾内植入构建原位肾细胞癌小鼠模型的方案 关键词：肾细胞癌，原位小鼠模型，肾内植入，肿瘤模型，癌症研究，实验动物模型

摘要

来源：Murphy, K. A. 等. 用于定量和纵向评估临床前治疗的同系小鼠转移性肾细胞癌模型. J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，我们建立了一种肾细胞癌的原位小鼠模型。该模型可在注射侧肾脏中形成可重复的原发性肿瘤，并在肺部产生转移性肿瘤，从而能够评估疾病进展及治疗效果。

方案

1. 细胞移植

为了将Renca细胞原位植入肾脏，需将Renca细胞重悬于Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，制备成浓度为2 × 10⁶ 个细胞/mL的单细胞悬液。

1. 使用含0.25%胰蛋白酶的HBSS从组织培养瓶中消化贴壁的Renca细胞。约5分钟后，向培养瓶中加入完全RPMI培养基以中和胰蛋白酶，并将细胞转移至离心管中进行洗涤。在300相对离心力下离心细胞 g 力（rcf × g在25 °C下反应5分钟。
2. 弃去上清液，用HBSS重悬细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并用HBSS调整体积，使细胞浓度达到2 × 10⁶⁶ cells/mL
3. 用一支配有18号针头的1 mL注射器吸取细胞，以防止细胞受到剪切应力。注射肿瘤细胞前，将18号针头更换为28号针头。注射0.1 mL体积可递送2 × 10⁵ 细胞注入肾脏。

2. 手术区域准备

1. 在生物安全柜内准备无菌手术区域，将无菌手术单铺在加热垫上。准备好所有用品，包括镊子、手术刀、剪刀、眼药水、5% 聚维酮碘消毒剂和无菌纱布。使用前将所有器械进行高压灭菌。
2. 采用无菌操作技术进行手术。在不同动物之间使用干热灭菌器对器械重新灭菌。佩戴无菌手套、实验服和口罩。

3. 动物准备

1. 根据机构指南，通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮/赛拉嗪（分别为 87.5 mg/kg 和 12.5 mg/kg）进行麻醉。通过夹捏脚趾判断麻醉深度。
2. 当动物确认无反应时，用手拔除或使用电推剪剃除 Balb/c 小鼠注射部位（例如 左侧腹侧）的毛发，以准备手术区域。
3. 将小鼠从术前准备区（例如 饲养笼）转移至手术区域，并在眼睛上涂抹兽用眼膏以防止干燥。用 5% 聚维酮碘消毒剂充分擦拭已准备好的切口部位。
4. 作为术前镇痛，在即将切开的部位皮下注射盐酸布比卡因（0.1 mL，2.5 mg/mL 溶液）。
5. 使用无菌手术刀或剪刀在动物左侧腹侧做单一切口（约 1.0  至 1.5 cm），操作需谨慎，避免穿透腹膜。用无菌剪刀分离真皮层与腹膜。用无菌棉纱布轻拭切口部位以清除血液。
6. 用双手握住小鼠，左手固定头部，右手支撑腹侧。
7. 透过腹膜辨认脾脏，并用右手的一根手指从下方触诊小鼠，此时肾脏应可通过腹膜可见。牢固固定动物，使腹膜和肾脏保持张力。
8. 由第二人使用配备 28 号针头的 1 mL 注射器，将肿瘤细胞（按第 1.2 节制备）经完整的腹膜注入肾脏中心。缓慢注入 0.1 mL（2 × 10⁵）细胞。注射完成后，将针头留置原位 5–10 秒，以减少细胞回流。 需特别注意，此步骤中注射者所持针头将靠近持鼠者的指尖，必须格外小心。
9. 拔出针头，并用一层薄薄的氰基丙烯酸酯组织粘合剂封闭切口。
10. 将动物放回清洁笼盒中，并垫上无菌纸巾。让动物在加热垫上恢复，恢复期间不得无人看管。直到动物恢复直立姿势和胸卧位后，方可将其返回标准饲养环境。所有涉及实验动物的操作均须遵循机构指南。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人工泪液眼膏	Akorn	NDC 17478-162-35
Vetbond 组织粘合剂	3M	CBGBIW011019
聚维酮碘溶液（5%）  NDC	普渡制药有限公司	67618-155-32
0.25% 布比卡因（盐酸布比卡因注射液）	Hospira	0409-1587-50
加热垫	Sunbeam
BD 注射器		309659
纱布	Venture	908291
氯胺酮	Phoenix Pharmaceuticals NDC	57319-609-02
赛拉嗪	Akorn NDC	59399-111
Hank’s 平衡盐溶液	Sigma-Aldrich	H2387
剪刀
镊子
Renca	ATCC	CRL-2947