基于反向蛋白相阵列的蛋白质表达分析：一种同时定量细胞裂解液中多种蛋白质表达水平的方法

摘要

来源：O'Mahony, F. C. 等. 利用反相蛋白质微阵列（RPPA）探索个体肾细胞癌中蛋白质表达的差异. 视觉化实验杂志 (2013)

本视频展示了如何进行反向蛋白相阵列（RPPA）以研究细胞裂解液中的蛋白质表达模式。在RPPA中，含有多种蛋白质的裂解液被点样到硝酸纤维素载玻片上，然后使用荧光标记的抗体检测目标蛋白质。

方案

1. RPPA 打印

1. 使用 MicroGrid II 机器人点样仪将蛋白质裂解液点样到硝酸纤维素包被的玻片（Fastslides-Whatman）上。所用玻片包含两个点样区域，每个区域点样相同的样本，在本例中为 100 个样本。其他可选规格包括 1、8 和 16 个点样区域的玻片。点样区域数量越多，每个区域可点样的样本数量就越少。
2. 对每个样本进行连续五次两倍稀释，每种稀释液均三点重复点样（每个样本共产生 15 个点样点）。

2. RPPA 蛋白质检测

1. 用过量的LiCor封闭缓冲液（按1:1比例用PBS稀释）润湿载玻片，在室温下于摇床上孵育1小时。
2. 将一抗按所需浓度用LiCor封闭缓冲液（按1:1比例用PBS稀释）配制800 μL，并置于冰上保存。
3. 将载玻片安装至（i）单孔芯片夹（Chip Clip）或（ii）四孔“FastFrame”载玻片支架中，确保载玻片与孵育腔之间形成紧密密封。
4. 吸除各孔中残留缓冲液，向相应孔中加入600 μL一抗溶液。
5. 将载玻片与孵育腔放入密封湿盒中，于4 °C在摇床上过夜孵育。
6. 配制0.1% PBS-Tween20（PBS-T；即100 μL Tween 20加入100 mL PBS中）。
7. 从冷藏室取出载玻片，小心吸除各孔中的一抗溶液。
8. 加入600 μL PBS-T，在室温下于摇床上洗涤5分钟，重复3次（×3）。
9. 将荧光标记的二抗用Odyssey封闭缓冲液（按1:1比例用PBS稀释）含0.01% SDS的溶液稀释至1:2,000（即1 μL/2 mL）进行配制。
10. 吸除孔中缓冲液，向各孔加入600 μL荧光标记的二抗溶液。室温下避光轻柔振荡孵育45分钟；在最终扫描前，必须始终保护膜免受光照。
11. 吸除孔中二抗溶液，于室温下用600 μL PBS-T短暂洗涤3次（×3）。将载玻片从支架上取下，转移至合适的容器中，用过量PBS-T避光洗涤15分钟。
12. 吸除PBS-T，再用PBS在室温下洗涤膜15分钟，以去除残留的Tween-20，过程中仍需保持膜避光。
13. 将Fastslide置于50 °C烘箱中干燥10分钟，然后在Li-Cor Odyssey扫描仪上进行扫描。在扫描完成前，始终保持载玻片避光。
14. 根据所使用的二抗，选择在680 nm和/或800 nm波长下扫描。对于双色检测，应始终使用高度交叉吸附的二抗以最小化交叉反应。双色检测时需谨慎选择一抗和二抗，其中最关键的是两种一抗应来自不同宿主物种（例如兔源和鼠源），从而可利用抗兔和抗鼠的二抗进行区分，这些二抗应标记有发射光谱易于区分的荧光染料。
15. 图像文件以.tiff格式保存。图1展示了扫描文件的图像。

结果

图1. RPPA扫描流程图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
吐温 X-100	Triton-X	T8787
Li-Cor Odyssey 封闭缓冲液	Li-Cor	927-40000
MicroGrid II 机器人点样仪	Biorobotics
FASTFrame' 四槽载玻片架	Whatman	10486001
FAST 载玻片 - 双垫	Whatman	10485317
IRDye 680LT 山羊抗小鼠 IgG	Licor	926-68020
IRDye 800CW 山羊抗兔 IgG	Licor	926-32211