基于反相蛋白质阵列的蛋白质表达分析:同时定量细胞裂解物中多种蛋白质表达的程序

Abstract

来源:O'Mahony， F. C. et al. 使用反相蛋白阵列 （RPPA） 探索个体肾细胞癌中的蛋白质表达变异。 （2013 年）

该视频演示了进行反相蛋白阵列 （RPPA） 以研究细胞裂解物中蛋白质表达模式的方法。在 RPPA 中，含有蛋白质混合物的裂解物打印在硝酸纤维素载玻片上，并使用荧光标记抗体分析目标蛋白质。

Protocol

1. RPPA 打印

1. 使用 MicroGrid II 机器人去样器将蛋白质裂解物点样到硝酸纤维素涂层载玻片 （Fastslides-Whatman） 上。使用的载玻片包含 2 个垫子，样品被点样到上面。每个垫子都用相同的样品点样，在本例中为 100 个样品。其他可用格式包括 1、8 和 16 焊盘幻灯片。焊盘数量越多，每个焊盘上可点样的样品数量就越少。
2. 从每个样品中制备一系列 5 次 2 倍稀释液，然后一式三份进行点样（每个样品总共 15 个点样）。

2. RPPA 蛋白检测

1. 湿滑玻片加入过量的 LiCor 封闭缓冲液（在 PBS 中以 50:50 稀释）。在摇床平台上在 RT 下孵育 1 小时。
2. 在 LiCor 封闭缓冲液（在 PBS 中以 50:50 稀释）中制备 800 μL 所需浓度的一抗，并保持在冰上。
3. 将玻片安装在 （i） 单框架 Chip Clip 或 （ii） "FastFrame"四槽玻片架中，以便在玻片和孵育室之间形成紧密密封。
4. 从孔中去除残留缓冲液，并向相应的孔中加入 600 μL 一抗。
5. 将载玻片和腔室放入密封的湿箱中，并在 4 °C 下在摇床上孵育过夜。
6. 配制 0.1% PBS-Tween20（PBS-T;100 μL 吐温 20/100 mL PBS）。
7. 从冷藏室中取出载玻片，小心地从每个孔中取出一抗。
8. 加入 600 μL PBS-T，并在 RT 下在摇摆平台上洗涤载玻片 5 分钟 （X3）。
9. 首先用 Odyssey 封闭缓冲液（在 PBS 中以 50:50 稀释）0.01% SDS 以 1:2,000 稀释度 （1 μL/2 mL） 稀释来制备荧光标记的二抗。
10. 从孔中取出缓冲液，向相应的孔中加入 600 μL 荧光标记的二抗。在室温下轻轻摇动孵育二抗 45 分钟;在最终扫描之前保护膜免受光线照射是很重要的。
11. 从孔中取出二抗，并在室温下用 600 μL PBS-T 短暂洗涤 （x3）。从载体中取出载玻片，转移到合适的容器中，用过量的 PBS-T 洗涤 15 分钟，将膜保持在黑暗中。
12. 去除 PBS-T 并在室温下进一步用 PBS 洗涤膜 15 分钟以去除残留的 Tween-20，再次将膜保持在黑暗中。
13. 将 Fastslide 在 50 °C 烘箱中干燥 10 分钟，然后在 Li-Cor Odyssey 扫描仪上扫描。将载玻片置于黑暗中，直到扫描完为止。
14. 在 680 nm 和/或 800 nm 处扫描载玻片，具体取决于所使用的二抗。对于双色检测，请始终使用高度交叉吸附的二抗，以尽量减少交叉反应性。仔细选择一抗和二抗对于双色检测是必要的。最重要的是为两种一抗选择不同的宿主物种（例如兔子和小鼠）。这允许通过用染料标记的抗兔和抗小鼠二抗进行区分，这些二抗具有易于区分的发射光谱。
15. 图像文件保存为 .tiff 文件。图 1 描述了扫描文件的图像。

Results

图 1. RPPA 扫描过程的流程图。

Materials