向斑马鱼胚胎静脉内微量注射肾毒素：一种将肾毒性物质递送至斑马鱼胚胎血液循环的技术

摘要

来源：McKee, Robert A. 等. 利用斑马鱼肾毒素微量注射建立急性肾损伤模型. J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了将肾毒素通过尾静脉显微注射到斑马鱼胚胎体内的方法，以研究这些化学物质对肾脏功能的影响。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 溶液的配制

1. 通过将73.0 g NaCl、3.15 g KCl、9.15 g CaCl₂ 和9.95 g MgSO₄ 溶于5 L蒸馏水中，配制50倍浓缩的E3胚胎培养基，并在室温下保存。
2. 通过将73.0 g NaCl、3.15 g KCl、9.15 g CaCl₂ 和9.95 g MgSO₄ 溶于5 L蒸馏水中，配制50倍浓缩的E3胚胎培养基，并在室温下保存。
3. 培养斑马鱼胚胎时，将50倍浓缩的E3胚胎培养基用蒸馏水稀释至1倍工作液，然后每1 L 1倍E3培养基中加入200 μl 0.05%亚甲蓝作为杀菌剂，并在室温下保存。
4. 通过将40 mL 50倍浓缩E3培养基与0.06 mg PTU（1-苯基-2-硫脲）混合，配制含0.003% PTU的色素抑制E3胚胎培养基，再用蒸馏水定容至2 L。
5. 在室温下搅拌E3/PTU溶液过夜，使PTU粉末充分溶解，然后将E3/PTU溶液于室温保存。
   注意：E3/PTU溶液的有效期约为一周，存放时间较长的溶液在抑制斑马鱼幼体色素发育方面的效果会降低。
6. 通过将1 g Tricaine（MS-222）加入500 mL蒸馏水中，并用1 M Tris缓冲液（pH 9.5）调节pH至7.2，配制0.2% Tricaine麻醉溶液。

2. 工具的准备

1. 通过在5" 直型解剖针末端安装凝胶上样枪头，并用胶带或超级胶水固定，制备用于在显微注射过程中定位胚胎的胚胎操作工具。
2. 使用拉针仪制备显微注射针：首先将一根经火焰抛光的10 cm带丝硼硅酸盐玻璃毛细管放入仪器中，并通过拧紧手柄固定玻璃管。
3. 拉制硼硅酸盐玻璃管以形成细锥形的注射针。使用以下参数：加热温度540，拉力245，速度200，时间125。
4. 将制好的注射针置于培养皿内，将其悬置于一条雕塑粘土条上以保护针尖，并盖上皿盖以防止灰尘积聚。
5. 为完成显微注射针的制备，使用剃须刀片或精细镊子的边缘切割拉制后的针端，形成直径约为0.05–0.1 mm的锐利角状注射尖端。
6. 制备显微注射用培养皿时，先在100 mL锥形瓶中配制1.5%琼脂糖/E3溶液，将E3溶液在微波炉中加热至沸腾以溶解琼脂糖，随后在室温下冷却约10分钟。
7. 将冷却后的琼脂糖/E3溶液倒入培养皿中，形成厚度约为0.5 cm的底层；待其凝固后，再倒入第二层，厚度约为0.3 cm，插入预制的胚胎凹槽模具，并在室温下静置使其完全凝固。
   注意：将模具插入上层琼脂糖/E3溶液时，应以倾斜角度插入，以减少气泡产生。
8. 当整个显微注射培养皿完全凝固后，使用刮勺缓慢而小心地将预制的胚胎凹槽模具取出，然后向培养皿中加入E3溶液，并于4 °C保存。

3. 肾毒素溶液的显微注射

1. 注射当天，配制所需肾毒素溶液及相应的溶剂对照液。
2. 涡旋或轻轻混匀，确保药物充分溶解，检查管壁及水柱顶部。
   注意：肾毒素溶液可加入微量荧光标记葡聚糖，用于监测显微注射效率，并在后续时间点评估肾脏清除能力。
3. 用细小的凝胶上样枪头将约 2–3 µL 肾毒素溶液从针尾注入已修剪的显微注射针中，并用胶带将针头垂直固定，使溶液在重力作用下充满针尖。
4. 待针尖充满后，将装有溶液的注射针固定于显微操作仪上。
5. 在测微载玻片上滴加一滴矿物油，通过向油中注射测试注射体积，观察液滴大小。500 pl 的注射体积对应直径为 0.1 mm 的液滴。
6. 从培养箱中取出胚胎培养皿，加入约 5 mL 的 0.2% 三卡因溶液进行麻醉。
7. 为确认麻醉完全，可用胚胎操作工具轻触胚胎，若无运动反应则表明麻醉充分。
8. 成功麻醉后，用移液管将胚胎转移至注射模具中。
9. 将每个胚胎调整至模具的不同孔中，使头部位于孔的最深处，躯干沿凹槽平放，尾部伸出凹槽。
10. 将装满溶液的注射针插入显微操作仪，并将针尖移至胚胎旁。
11. 向前推动操纵杆，将针头轻柔插入尾部血管，踩下脚踏开关完成显微注射。
    注意：可通过观察液体进入循环系统判断注射是否成功。此外，在肾毒素中共同注射荧光标记葡聚糖，可使研究人员在操作后验证注射是否成功。
12. 向后轻拉操纵杆，将针头从胚胎中撤出。
13. 注射完成后，将胚胎转移至洁净培养皿中，用新鲜 E3/PTU 溶液冲洗以去除三卡因。
14. 将胚胎继续培养至所需时间点，以评估形态学变化。形态学结果可用甲基纤维素封片介质进行拍照记录，或根据需要进行后续实验分析。
    注意：应评估胚胎恢复情况，统计出现水肿的个体百分比，水肿通常提示肾脏损伤。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	American Bioanalytical	AB01915
氯化钾	American Bioanalytical	AB01652
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M7506
氯化钙	American Bioanalytical	AB00366
N-苯基硫脲（PTU）	Aldrich Chemistry	P7629
氨基苯甲酸乙酯（Tricaine）	Fluka Analytical	A5040
硼硅酸盐玻璃	Sutter Instruments Co.	BF100-50-10
Flaming/Brown 微量移液器拉制仪	Sutter Instruments Co.	Mo. P097
UltraPure 琼脂糖	Invitrogen	15510-027
Falcon 一次性培养皿，无菌，Corning：
60 mm × 15 mm	VWR	25373-085
100 mm × 15 mm	VWR	25373-100
微量注射用托盘 150 mm × 15 mm	VWR	25373-187
低温培养箱	Fischer Scientific	11 690 516DQ
显微解剖镊	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010
千分尺	Ted Pella, Inc.	2280-24