肾脏平铺制备：一种用于成年斑马鱼肾脏显微分析的解剖与平铺制备方法

摘要

来源：McCampbell, K. K. 等. 成年斑马鱼肾脏中肾单位组成与功能的分析. J. Vis. Exp. (2014)

本视频展示了成年斑马鱼肾脏的解剖与制片过程，制备得到的铺片可用于显微镜下观察，以便对样本进行分析。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 从未经固定的成年斑马鱼样本中解剖并制备肾脏平铺标本，以观察近端小管的荧光葡聚糖标记

1. 将注射了葡聚糖的成年斑马鱼放入含有0.2% Tricaine（pH 7.0）的培养皿中4–5分钟，以实施安乐死。
   注意：在继续操作前，需仔细观察鱼的鳃是否停止运动、心脏是否停止跳动，以确认其已死亡。
2. 使用塑料勺将鱼从Tricaine溶液中取出，倾去溶液，并将鱼体置于组织纸或滤纸上。
3. 使用锋利的解剖剪在鳃盖后方剪开，移除头部。
4. 立即用解剖剪从头部开始沿腹面做一长切口，一直延伸至尾鳍基部，打开鱼体。
5. 使用精细镊子去除鱼的内脏器官。
6. 使用超细解剖针将体壁固定展开，以便观察附着于动物背部体壁的肾脏器官。
7. 使用精细镊子将肾脏从背部体壁上分离下来。
8. 将肾脏轻轻放入含有1X PBS的5 mL玻璃小瓶中，每次用3–5 mL新鲜1X PBS洗涤，共洗涤3次，每次5分钟。
   注意：使用玻璃小瓶处理成年斑马鱼肾脏样本有助于组织的可视化，并允许使用较大体积（相对于组织质量）的洗涤液（约3–5 mL）。也可使用12孔细胞培养板。虽然可使用塑料微量离心管，但标准尺寸（1.5 mL）可能限制洗涤效果。
9. 用移液器将肾脏取出，置于洁净的载玻片上，加入1–2滴1X PBS。
10. 使用精细镊子将肾脏在载玻片上压平，确保组织无卷曲或翻折。
    注意：也可使用钨丝工具在结缔组织上做微小切口，以帮助肾脏平整展开。
11. 在18 × 18 mm的盖玻片四角各放置一小块模型黏土，然后缓慢将盖玻片覆盖在肾脏上。
    注意：放置盖玻片时应略微倾斜，以尽量减少溶液中气泡的滞留。模型黏土凹陷的直径约为2 mm（图1A）。也可用真空脂代替模型黏土制作凹陷。如有需要，可额外添加一滴1X PBS以填充盖玻片与载玻片之间的空隙。
12. 将载玻片置于体视显微镜或复合显微镜的视野中，使用适当的滤光片进行观察和/或成像。

结果

图1. 成年斑马鱼肾脏平铺制备及其在可视化肾单位近端小管（PCT）摄取荧光标记葡聚糖中的应用。（A） 肾脏标本平铺制备的明场图像，其中器官被平整地放置在载玻片上，组织上方覆盖盖玻片，并由四小团油灰（亮粉色）支撑。此处肾脏制备样本与刻度尺并列成像，以提供比例参照。典型的成年斑马鱼肾脏从头到尾长约5–7毫米（mm）。（B） 未经漂白的肾脏明场图像。黑色色素沉着对应于与肾脏相关分布的黑色素细胞群，主动脉沿肾脏中线走行。（C） 成年斑马鱼经腹腔注射40 kDa荧光素标记葡聚糖（FITC）后第3天，未经漂白处理的肾脏中肾单位PCT段的可视化图像。PCT段在整个肾脏中可见，但...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1X PBS			用蒸馏水稀释10X PBS制备。
精细镊子 	Roboz 	RS-1050	Dumont #55型镊子
载玻片  	Thermo-Fisher	4445	White Frost
盖玻片 	Thermo-Fisher  	12-540A	18 × 18 mm
油泥  	Hasbro	Playdoh	可使用其他类型的油泥替代，效果相似。 
玻片架  	Thermo-Fisher	12-587 	可选：用于平放保存玻片的纸板托盘。
体视显微镜	Nikon	SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC	所用滤光片组如下：Hoechst/DAPI滤光片用于DAPI、碘化丙啶、葡聚糖-级联蓝和碱性磷酸酶的检测；GFP/FITC滤光片用于葡聚糖-FITC、葡聚糖-荧光黄和抗GFP的检测；TRITC滤光片用于葡聚糖-荧光红、PI和DBA的检测。
复式显微镜 	Nikon	96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red	所用滤光片组如下：Hoechst/DAPI滤光片用于DAPI、碘化丙啶、葡聚糖-级联蓝和碱性磷酸酶的检测；GFP/FITC滤光片用于葡聚糖-FITC、葡聚糖-荧光黄和抗GFP的检测；Texas Red滤光片用于葡聚糖-荧光红、PI和DBA的检测。