斑马鱼肾脏的脱色与预染色：一种用于成年斑马鱼肾脏染色前处理的技术 关键词：斑马鱼，肾脏，脱色，预染色，组织学染色，成年斑马鱼，肾脏制备

摘要

来源：McCampbell, K. K. 等. 成年斑马鱼肾脏肾单位组成与功能分析. J. Vis. Exp. (2014)

在本视频中，我们演示了成年斑马鱼肾脏的脱色素处理及其后续染色前的制备步骤。染色完成后，成年斑马鱼肾脏可用于研究肾脏再生、肾病模型的表型表征以及肾单位功能。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 成年斑马鱼肾脏的固定、解剖、通透及色素去除

1. 配制新鲜的固定液，含4%多聚甲醛（PFA）/1×PBS/0.1% DMSO，或解冻一份冷冻的4% PFA/1×PBS 溶液，并加入0.1% DMSO。
   注意：PFA具有毒性，操作PFA溶液时应在通风橱中进行，并穿戴适当个人防护装备，包括手套和实验服。此外，配制储备液时应小心操作PFA粉末。
2. 在解剖托盘中加入足量固定液，以完全浸没整个动物样本。
3. 处死并将在固定液中固定的斑马鱼样本进行固定。
   注意：所选鱼类可以是未经处理的斑马鱼肾脏标本，或之前接受过腹腔注射葡聚糖的斑马鱼中分离出的肾脏。
4. 在4 ^oC条件下对样本进行过夜（12–16小时）固定。
5. 次日，使用精细镊子小心地将肾脏从背部体壁分离，并用移液器将其转移至玻璃小瓶中。
   注意：也可使用12孔或24孔培养板。虽然可使用塑料微量离心管，但标准尺寸（1.5 mL）的管子可能限制洗涤操作。
6. 用3–5 mL 含0.05% Tween的1×PBS 对分离的肾脏进行3次洗涤，每次5分钟。
7. 去除含0.05% Tween的1×PBS，用3 mL 5%蔗糖溶液（溶于1×PBS）冲洗肾脏30分钟。
8. 更换为3 mL 30%蔗糖溶液（溶于1×PBS），在4 ^oC条件下过夜（12–16小时）保存。
   注意：蔗糖溶液可使细胞膜通透化，从而使标记试剂能够穿透组织并实现特异性标记。
9. 次日，去除30%蔗糖溶液，用5 mL 含0.05% Tween的1×PBS对肾脏进行两次洗涤，每次5分钟。
10. 将含0.05% Tween的1×PBS替换为3–5 mL 漂白液，以去除肾脏器官上的黑色素细胞色素沉着。
11. 将玻璃小瓶置于旋转器上，并密切观察色素消失情况。
    注意：通常在蔗糖处理后漂白过程约需20分钟，但有时可能长达60分钟。若漂白液在肾脏上作用时间过长，可能导致器官解体；建议每10–15分钟监测一次样本，以检查组织完整性。
12. 当肾脏色素完全去除后，用3–5 mL 含0.05% Tween的1×PBS洗涤两次。
13. 将含0.05% Tween的1×PBS替换为3–5 mL 4% PFA溶液，在室温下固定1小时。
14. 去除4% PFA溶液，用3–5 mL 含0.05% Tween的1×PBS对肾脏进行3次洗涤，每次5分钟。
    注意：固定完成后，也可将肾脏直接置于载玻片上，评估其在无黑色素细胞色素干扰下的葡聚糖摄取情况。
15. 去除含0.05% Tween的1×PBS ，替换为3–5 mL 封闭液，然后在室温下封闭孵育2小时。
16. 封闭完成后，可直接进入所选的染色方案。
    注意：此时肾脏可进一步进行一个或多个其他处理步骤，以使用不同试剂开展多重标记研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1X PBS			通过将10X PBS用蒸馏水稀释制备
1X PBST			含0.1% Tween-20去污剂的1X PBS
含0.05% Tween的1X PBS			含0.05% Tween-20去污剂的1X PBS
Tween 20	American Bioanalytical	AB02038
4% PFA/1X PBS			将4% PFA（w/v）（Electron Microscopy Sciences，货号#19210）溶解于1X PBS中，在通风橱内的加热板上加热至沸腾。冷却后分装并冷冻保存于-20°C。使用前解冻，切勿重复冻融
漂白液			漂白液配方（配制20 ml溶液）：1.6 ml 10%氢氧化钾溶液，0.6 ml 30%过氧化氢溶液，100 μl 20% Tween。用蒸馏水定容至20 ml
氢氧化钾	Sigma	221473
过氧化氢	Sigma	H1009
封闭液			封闭液（配制10 ml溶液）：8 ml 含0.05% Tween的1X PBS，2 ml 胎牛血清，150 μl DMSO