扩展病理学:一种对临床组织样本进行高分辨率光学成像的方法

摘要

来源:Klimas， A. et al. 通过物理和各向同性膨胀对人体组织切片进行纳米成像。J. Vis. Exp.（2019 年）

在本视频中，我们描述了一种称为扩增病理学的方法，这是膨胀显微镜的一种变体，其中临床组织标本使用聚合物网络进行化学膨胀，用于纳米级结构的显微镜检查。

方案

1. 试样的原位聚合

1. 在锚固溶液中孵育标本。
   1. 通过在 1x PBS 中将 AcX 储备液稀释至浓度为 0.03 mg/mL（对于使用非醛固定剂固定的样品）或 0.1 mg/mL（对于使用醛固定剂固定的样品），制备锚定溶液（通常 250 μL 足以覆盖组织切片），醛固定剂中可与 AcX 反应的游离胺较少。
   2. 将载玻片放入 100 mm 培养皿中，并将锚定溶液移液到组织上。在 RT 下孵育至少 3 小时或在 4 °C 下过夜。
2. 在胶凝溶液中孵育样品。
   1. 准备至少 100 倍过量体积的胶凝溶液。每 200 μL 按顺序混合以下物质:188 μL 单体溶液、4 μL 0.5% 4HT 储备液（1:50 稀释，终浓度:0.01%）、4 μL 10% TEMED 储备液（1:50 稀释，终浓度 0.2%）和 4 μL 10% APS 储备液（1:50 稀释，终浓度 0.2%）。
      注意:凝胶溶液应在使用前立即制备。溶液应保持在 4 °C，最后加入 APS 溶液，以防止过早胶凝。
   2. 从组织切片中取出多余的溶液，并将载玻片放入 100 mm 培养皿中。向样品中加入新鲜的冷胶凝溶液，并在 4 °C 下将混合物在组织上孵育 30 分钟，以使溶液扩散到组织中。
3. 在样品周围的载玻片上构建一个腔室（图 1A），而不会干扰胶凝溶液。
   1. 用金刚石刀将盖玻片切成薄片，为胶凝室制作垫片。
      注意:为了便于膨胀后成像，垫片的厚度应接近组织标本，以减少组织上方的空白凝胶量。1.5 号玻璃可用于标准临床样品 （5-10 μm）。盖玻片可以堆叠用于较厚的样品。
   2. 使用水滴 （~10 μL） 固定组织两侧的垫片。
   3. 小心地将盖上玻璃盖在载玻片上，确保避免气泡滞留在组织上（图 1B）。
4. 将样品在 37 °C 下在潮湿环境（例如带有湿擦的密闭培养皿）中孵育 2 小时
   注意:该协议可以在此处暂停。载玻片室可以储存在 4 °C 的密封培养皿内。

2. 样品消解

1. 将剃须刀片轻轻滑到盖玻片下方，然后慢慢将盖玻片从凝胶表面提起，取下胶凝室的盖子。修剪组织周围的空白凝胶以尽量减少体积。不对称地切割凝胶以跟踪均质化后凝胶的方向，因为样品会变得透明。
   1. 使用前，在消化缓冲液（终浓度 4 U/mL）中以 1:200 稀释 ProK。准备足够的溶液以完全浸没凝胶;四孔塑料细胞培养板的单孔每孔至少需要 3 mL。
   2. 将样品在含有消化缓冲液的密闭容器中于 60 °C 孵育 3 小时。如果样品在消解过程中没有从玻片上脱落，请使用剃须刀片轻轻取出样品。
      注:样品应完全浸没在消化缓冲液中，以防止样品变干，并放置在可以用薄膜密封的有盖容器（小载玻片盒、塑料孔、培养皿等）中。

3. 样品扩展和成像

1. 使用软画笔将标本转移到与所需成像系统兼容的容器中的 1x PBS 中，并且足够大以容纳完全膨胀的凝胶。如果在倒置系统上成像，请确保将组织样品面朝下放置，如果在正置系统上成像，请确保组织朝上放置，以尽量减少成像物镜与样品的距离。如果需要，用软画笔翻转凝胶。
   注意: LED 的侧向照明可用于使它们在液体中可见。标准 6 孔板可容纳预膨胀直径小于 0.6 cm 的样品。玻璃底孔板应用于倒置系统的成像。
2. 在 RT 下用 1x PBS 洗涤样品 10 分钟。如果需要，用 300 nM DAPI 对样品重新染色，因为消化过程会洗掉 DAPI 染色剂。去除 PBS 并在 RT 下用 1x PBS 稀释的 300 nM DAPI 染色 20 分钟，然后在 RT.
   下用 1x PBS 洗涤 10 分钟 注意:样品可以用 1x PBS 覆盖并储存在 4 °C 下，然后再进行下一步。
3. 要扩增样品，请更换 PBS 并用过量体积的 ddH₂O（至少是最终凝胶体积的 10 倍）洗涤 3-5 次，每次 10 分钟，在 RT.
   下 注意: ^{第 3 次}或^{第 4 次}洗涤后，标本的膨胀应开始趋于稳定。为了储存，为了防止细菌生长，ddH₂O 可以补充 0.002%−0.01% 叠氮化钠 （NaN₃）。在这种情况下，最终膨胀系数可逆地降低 10%。
4. 使用常规宽视场显微镜、共聚焦显微镜或其他选择的成像系统进行荧光成像><。 注意: 为防止凝胶漂移，可以从孔中去除多余的液体。凝胶也可以用 1.5−2% 低熔点琼脂糖固定。在体积为 2-4 倍溶液的容器中，在水中制备 1.5-2%（w/v） 低熔点琼脂糖。在 40 °C 水浴中或微波炉中加热溶液 10-20 秒以熔化溶液。将熔化的琼脂糖移液到凝胶边缘周围。让琼脂糖在 RT 或 4 °C 下硬化后，向样品中加水以防止脱水。

结果

图 1:用于病理样品的凝胶室。（A） 在 4 °C 的胶凝溶液中孵育样品后，将两个垫片，例如两片用金刚石刀切割的 #1.5 盖玻片放置在组织的两侧。垫片应比组织切片厚，以防止压迫样品。（B） 在 37 °C 下孵育之前，使用盖子（例如一块 #1.5 盖玻片）盖住样品。

材料