扩增病理学：一种用于临床组织样本高分辨率光学成像的方法

摘要

来源：Klimas, A. 等 通过物理性各向同性膨胀实现人体组织切片的纳米级成像。J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们介绍一种称为扩增病理学的方法，它是扩增显微技术的一种变体，通过聚合物网络对临床组织样本进行化学扩增，以实现对纳米级结构的显微观察。

方案

1. 样品的原位聚合

1. 将样本在锚定溶液中孵育。
   1. 通过将 AcX 储存液用 1× PBS 稀释，配制锚定溶液（通常 250 µL 即足以覆盖组织切片）：对于使用非醛类固定剂固定的样本，稀释至浓度为 0.03 mg/mL；对于使用醛类固定剂固定的样本（其可用于与 AcX 反应的游离胺基较少），稀释至浓度为 0.1 mg/mL。
   2. 将载玻片放入 100 mm 培养皿中，并用移液器将锚定溶液加至组织上。在室温下孵育至少 3 小时，或在 4 °C 下过夜孵育。
2. 将样本在凝胶溶液中孵育。
   1. 准备至少 100 倍体积过量的凝胶溶液。每 200 µL，按以下顺序混合：188 µL 单体溶液、4 µL 0.5% 4HT 储存液（1:50 稀释，终浓度：0.01%）、4 µL 10% TEMED 储存液（1:50 稀释，终浓度 0.2%）和 4 µL 10% APS 储存液（1:50 稀释，终浓度 0.2%）。
      注意：凝胶溶液应在使用前立即配制。溶液应保持在 4 °C，APS 溶液应最后加入，以防止提前凝胶化。
   2. 去除组织切片上的多余液体，并将载玻片放入 100 mm 培养皿中。向样本上加入新鲜且预冷的凝胶溶液，在 4 °C 下孵育 30 分钟，以使溶液充分扩散进入组织。
3. 在载玻片上围绕样本构建一个腔室（图 1A），注意不要扰动已有的凝胶溶液。
   1. 使用金刚石刀将盖玻片薄切，制成凝胶腔室的间隔垫。
      ​注意：为便于扩增后成像，间隔垫的厚度应尽量接近组织样本的厚度，以减少组织上方无结构凝胶的厚度。对于标准临床样本（5−10 µm），可使用 1.5 号玻璃。对于较厚的样本，可堆叠多片盖玻片作为间隔垫。
   2. 在组织两侧使用水滴（约 10 µL）固定间隔垫。
   3. 小心地将盖玻片盖在载玻片上，确保组织区域上方不产生气泡（图 1B）。
4. 将样本置于湿润环境（如内含湿巾的密闭培养皿）中，在 37 °C 下孵育 2 小时。
   注意：此处可暂停实验流程。载玻片腔室可密封后在 4 °C 下保存。

2. 样品消化

1. 用剃须刀片轻轻插入封片与凝胶表面之间，缓慢抬起盖玻片，取下凝胶室的盖子。修剪组织周围的空白凝胶以尽量减少体积。将凝胶切成不对称形状，以便在均质化后追踪凝胶的方向，因为样品将变得透明。
   1. 使用前，用消化缓冲液按1:200比例稀释蛋白酶K（最终浓度为4 U/mL）。准备足量溶液以完全浸没凝胶；每个四孔塑料细胞培养板的单个孔至少需要3 mL溶液。
   2. 将样品置于含有消化缓冲液的密闭容器中，在60 °C下孵育3小时。如果样品在消化过程中未从载玻片上脱落，可用剃须刀片轻轻移除样品。
      注意：标本应完全浸没在消化缓冲液中，以防止样品干燥，并置于可密封的密闭容器（小型载玻片盒、塑料孔板、培养皿等）中，容器需用封口膜密封。

3. 样本扩增与成像

1. 使用软毛画笔将样本转移至与目标成像系统兼容且足以容纳完全膨胀凝胶的容器中的1x PBS中。若使用倒置成像系统，需将样本面朝下放置；若使用正置成像系统，则将样本面朝上放置，以最小化成像物镜与样本之间的距离。必要时可用软毛画笔翻转凝胶。
   注意： LED 侧向照明可用于使液体中的样品可见。标准的 6 孔板可容纳预扩张直径小于 0.6 cm 的样品。在倒置系统上成像时应使用玻璃底孔板。
2. 在室温下用1×PBS清洗样品10分钟。如需要，可在消化过程后重新使用300 nM DAPI染色，因为该过程会洗去原有的DAPI染料。吸除PBS，加入用1×PBS稀释的300 nM DAPI溶液，在室温下染色20分钟，随后在室温下用1×PBS清洗10分钟。
   注意： 样品可用1×PBS覆盖，并在4 °C保存，直至进行下一步操作。
3. 为扩增样本，用过量的ddH₂O替代PBS并进行洗涤₂O（至少为最终凝胶体积的10倍）重复3−5次，每次10分钟，室温下进行。
   注意： 3之后^rd 或 4^th 洗涤后，样本的膨胀应开始趋于平稳。储存时，为防止细菌生长，需将ddH₂O₂O 可补充 0.002%−0.01% 叠氮化钠（NaN₃在此情况下，最终膨胀因子可逆地降低了10%。
4. 使用常规的宽场显微镜、共聚焦显微镜或其他选定的成像系统进行荧光成像。
   注意： 为防止凝胶漂移，可移除点样孔中的多余液体。也可使用1.5−2%低熔点琼脂糖固定凝胶。在容积为溶液体积2−4倍的容器中，配制1.5−2%（w/v）的低熔点琼脂糖水溶液。将溶液置于40 °C水浴或微波炉中加热10−20秒，使其完全融化。用移液器将融化的琼脂糖沿凝胶边缘加入。待琼脂糖在室温或4 °C下凝固后，向样品中加入水以防止脱水。

结果

图1：病理样本的凝胶化装置。（A）将样本在4 °C下孵育于凝胶溶液后，在组织两侧各放置一个垫片（例如用钻石刀切割的#1.5盖玻片碎片）。垫片应比组织切片更厚，以防止样本受压。（B）在37 °C孵育前，使用盖片（例如一片#1.5盖玻片）覆盖样本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6孔玻璃底培养板（#1.5 盖玻片）	 Cellvis	 P06-1.5H-N
丙酮	 Fischer Scientific	 A18-500
丙烯酰胺	 Sigma Aldrich	 A8887
丙烯酰基-X SE（AcX）	 Invitrogen	 A20770
琼脂糖	 Fischer Scientific	 BP160-100
过硫酸铵（APS）	 Sigma Aldrich	 A3678	 引发剂
DAPI（1 mg/mL）	 Thermo Scientific	 62248	 细胞核染色剂
88号金刚石刀片（CM型）	 General Tools	 31116
乙醇	 Pharmco	 111000200
乙二胺四乙酸（EDTA）0.5 M	 VWR	 BDH7830-1
石蜡包埋肾组织样本（FFPE）	 USBiomax	 HuFPT072
镊子
显微盖玻片 #1（24 mm × 60 mm）	 VWR	 48393 106
显微盖玻片 #1.5（24 mm × 60 mm）	 VWR	 48393 251
N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）	 Sigma Aldrich	 T9281	 加速剂
N,N′-亚甲基双丙烯酰胺	 Sigma Aldrich	 M7279
Nunclon 6孔细胞培养皿	 Thermo Fisher	 140675
Nunc 15 mL 圆锥形离心管	 Thermo Fisher	 339651
Nunc 50 mL 圆锥形离心管	 Thermo Fisher	 339653
旋转摇床
画笔
pH计
磷酸盐缓冲液（PBS）10× 溶液	 Fischer Scientific	 BP399-1
塑料培养皿（100 mm）	 Fischer Scientific	 FB0875713
蛋白酶K（分子生物学级）	 Thermo Scientific	 EO0491
剃刀刀片	 Fischer Scientific	 12640
安全锁扣微量离心管 1.5 mL	 Thermo Fisher	 3457
安全锁扣微量离心管 2.0 mL	 Thermo Fisher	 3459
丙烯酸钠	 Sigma Aldrich	 408220
氯化钠	 Sigma Aldrich	 S6191
柠檬酸三钠二水合物	 Sigma Aldrich	 C8532-1KG
Tris碱	 Fischer Scientific	 BP152-1
吐温-100（Triton X-100）	 Sigma Aldrich	 T8787
二甲苯	 Sigma Aldrich	 214736