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所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 通过一种新型手术方法在液体成像柱下方经侧向移液管通路进入肾脏
注意：成像支撑系统和手术准备的组装如图1所示。所述操作在体重为20–25 g的C57BL/6小鼠上进行。
- 称量小鼠体重。
- 使用4%异氟烷诱导麻醉，并以空气/氧气混合气体中1.5–2.5%异氟烷维持麻醉。通过检测对疼痛刺激无反应及呼吸频率降低来确认小鼠已处于麻醉状态。
- 润滑小鼠眼睛，将其侧卧固定于基板上，使用胶带固定四肢。
- 皮下注射200 µL生理盐水，并插入直肠温度探头。手术期间使用加热灯、成像期间使用加热垫控制体温。
- 使用脱毛膏去除小鼠左侧体表的所有毛发。
- 定位脾脏（皮下可见），并在脾脏背侧和尾侧定位左肾。
- 在皮肤上做0.5 cm切口，在腹膜上做较小切口，大小以足以使肾脏顺利突出为宜。
- 轻柔施压使肾脏外露。将由聚硅氧烷制成的肾脏稳定模具置于肾脏周围，并用氰基丙烯酸酯胶水固定。对齐肾脏与间隔器，使肾脏最外侧表面超出稳定器约1 mm。
- 用胶水将头板固定在稳定模具上，并将头板安装至基板上的固定杆。
- 在聚硅氧烷支撑结构围绕肾脏形成的凹槽中填充1%琼脂糖溶液，将10 mm盖玻片覆盖其上并固定直至琼脂糖凝固。用胶水将盖玻片密封至头板，并用牙科水泥在盖玻片周围构建密封环。
- 经眼眶后静脉丛注射FITC-葡聚糖（2,000,000 Da，5%溶液，100–150 µL），迅速将小鼠及固定装置转移至双光子显微镜载物台，持续维持麻醉，并确保显微镜载物台具备充分的废气收集系统。
2. 选择合适的肾小球并用移液管进入鲍曼氏囊腔
- 定义：
- 将 X 定义为屏幕上的左右方向，以及面对显微镜时的左右方向
- 从载物台控制器读取 SX（载物台 X）值
- 将 PX 定义为移液管 X，即移液管调节控制器上的读数
- 将 Y 定义为屏幕上的上下方向，向前朝向显微镜，向后朝向双光子系统
- 将 Z 定义为向上朝向天花板，向下朝向地面，并通过物镜 Z 位置在载物台上进行测量
- 将 S(O)Z 定义为载物台（实际上是物镜）的高度
- 在目镜中使用绿色荧光蛋白（GFP）滤光片设置识别肾脏表面。由于注射了异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-Dextran），血管将呈现明亮的绿色。
- 识别一个合适的肾小球。在通过目镜确定肾脏表面后，切换至双光子模式（非扫描模式），并探索成像窗口。适合进行微穿刺的特征包括：肾小球距离盖玻片的垂直距离 >30 µm（以防止穿刺过程中移液管与盖玻片发生碰撞），以及肾小球距离肾脏侧包膜的横向距离 <400 µm（超过此距离，移液管的偏移可能增加穿刺失败的概率）。
- 记录穿刺点的横向和垂直距离，穿刺点为肾包膜上正对移液管一侧的肾小球所在位置。
- 将物镜焦点提升至水柱中，保持载物台的 X 和 Y 坐标不变，仅提升约 1 厘米。
- 将移液管尖端插入水柱中，并开启 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）激发光源。在 X 和 Y 方向上移动移液管，使其尖端荧光信号最强，该位置即为物镜中心。若无此精确预定位，很难在目镜中找到移液管。由于量子点在不同激发波长下均发出相同波长（本例中为红色）的荧光，DAPI 激发可产生红色荧光，且该荧光高度聚焦于移液管尖端，如 图 2 所示。
- 将激发光源切换至红色荧光蛋白（RFP），在目镜中观察移液管，并将其精确置于视野中心。
- 切换至双光子模式，在双光子图像中找到移液管，并将其精确置于图像中心。此位置即为配准位置。
- 保存一张移液管的图像。
- 对载物台与微移液管控制器的坐标进行配准。
注意： 可使用附带的 .html 文件，该文件将通过 JavaScript 代码执行计算（在未安装电子表格软件的系统上具有优势），或使用电子表格计算载物台与移液管坐标之间的偏移量，并计算移液管控制器的目标坐标。
- 沿 X 轴将移液管从水柱中移出，保持 Z 和 Y 坐标不变。
- 将移液管 Z 坐标移动至目标肾小球的 Z 位置（即，将移液管在 Z 方向上向下移动至盖玻片以下）。
- 将移液管 Y 坐标移动至目标肾小球的 Y 坐标。
- 将双光子实时成像切换至目标肾小球的 Z 位置，然后移至肾脏边缘，并记录 SX 值。
- 利用配准时的 SX 偏移量，计算肾脏边缘对应的 PX 值。
- 将载物台向移液管方向移动（增加 SX），使肾脏边缘位于屏幕左侧较远处，但仍保持可见。
- 快速将移液管推进至比上述计算所得肾脏边缘 PX 值小约 100 µm 的位置。
- 定位移液管尖端，缓慢推进移液管。提高红色增益并观察红色像素直方图（由于量子点亮度极高以及非特异性荧光，像素分布会在移液管出现在成像窗口前发生偏移）。
- 在双光子实时成像下将移液管推进至肾脏边缘。
注意： 在进入肾包膜之前，可在 Y 和 Z 方向上调整移液管方向。但此操作可能导致移液管尖端断裂。若移液管偏离目标，更稳妥的做法是沿 X 方向回撤最多 2 cm，重新调整方向，再沿 X 方向返回至肾脏边缘。一旦移液管进入组织，除 X 轴外的任何轴向移动均会导致移液管弯曲，此类操作需极丰富经验才能有效利用，且常导致移液管断裂。
- 沿 X 轴缓慢推进移液管至目标肾小球的 PX 位置，同时密切关注 SX 值。（可定期返回肾小球位置，检查其在微移液管插入后是否发生位移，这将有助于操作。）
- 当到达正确位置时，使用 Z 轴层扫成像记录位置。
注意： 移液管就位后，可注入药物、蛋白质或荧光示踪剂，可抽吸液体用于后续分析，或测量相对于另一电极的压力或电荷。
3. 从鲍曼囊腔抽吸液体
- 将微量泵设置为在 2 分钟内注入 100 nL 全氟十氢萘，以确保移液管通畅，并减少穿刺过程中因移液管堵塞带来的干扰。重新成像以确认移液管位置。
- 等待 4–6 分钟以进行额外的滤过。
- 设置微量泵以最高 50 nL/min 的速率抽吸最多 300 nL。
注意：采用此速率未观察到肾小球形态的变化，表明其在抽吸过程中不会改变液体进入肾小囊腔的速率。由于该方法不使用传统微穿刺中的油滴阻断，因此为质谱分析而回收的样本体积可能包含部分注入的全氟十氢萘及可能的肾小管液。对于离子选择性电极测定、荧光光谱、聚合酶链式反应及其他敏感检测方法，可使用较小体积。若终点检测非质谱分析，则可在储存前使用矿物油和标准微穿刺技术测量抽吸体积。
- 再次进行成像。
- 撤出移液管并保存样本，在分析前加入 TRIS 缓冲液并于 -80°C 保存。
- 使用过量异氟烷或其他经批准的方法处死小鼠。
注意：滤过液通过肾小球毛细血管的滤过作用进入肾小囊腔。小鼠单个肾单位肾小球滤过率（SNGFR）报道范围为 8–14 nL/min。然而，SNGFR 受Starling力调控，因此肾小囊腔内的负性静水压可能增加 SNGFR。标准微穿刺方法使用矿物油阻断肾小管并在中性压力下采集肾小管液，但这些化合物会干扰质谱分析（见下文）；因此，在本技术中，近端小管保持通畅。此外，在抽吸时，肾小囊腔内含有未知但为正量的滤过液。因此，液体抽吸速率可能超过 SNGFR。
注意：在本研究所描述的实验中，目标是获取比常规更大的肾小球滤过液样本，用于基于纳米蛋白质组学技术的质谱分析。由于质谱分析不能使用矿物油或石蜡等油滴阻断（这些为复杂的有机分子混合物，会降低质谱的信噪比），故采用全氟十氢萘填充微量移液管和注射器。全氟十氢萘已知不会阻断肾小管流动，且具有生物惰性，不会干扰质谱分析。
