利用鸡胚尿囊膜进行肾脏类器官培养：一种将小鼠肾脏外植体移植至鸡胚尿囊膜以诱导肾血管结构形成的实验技术 关键词：肾脏类器官培养，鸡胚尿囊膜，小鼠肾脏外植体，肾血管结构，器官移植，血管生成，类器官系统，发育生物学，组织工程，肾单位形成

摘要

来源：Kaisto, S. 等. 肾脏类器官与类器官型培养在血管化、长期发育及显微成像优化中的改进。J. Vis. Exp. (2020)

本视频介绍了一种利用禽类胚胎绒毛尿囊膜（CAM）上改进的异种移植体系来研究器官发育的方法。该方法可实现体外培养的胚胎器官和类器官的完全血管化发育。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核

1. 小型储液器的制备及其在鸡胚尿囊膜上培养小鼠胚胎肾脏和肾类器官并建立异种移植实验

1. 使用专为6孔或12孔板设计的Transwell细胞培养小室。
   注意：根据具体实验需求，可使用大号或小号微型储液槽。当移植不超过八个胚胎肾脏，或需在同一鸡胚上放置多个微型储液槽时（例如在同一鸡胚CAM上同时进行实验组与对照组操作），建议使用小号微型储液槽。
2. 使用装有圆锯刀片的旋转多用工具或手锯，将小室侧壁切除，制成一个高2 mm、底部带有可透膜的塑料环。
3. 用手术刀或锋利刀片修整这些微型储液槽的边缘。
4. 将微型储液槽置于70%乙醇中灭菌至少1小时。
5. 用高压灭菌的双蒸水清洗微型储液槽，并在超净工作台中晾干。
6. 用PBS和培养基（高糖DMEM/10% FBS/1%青霉素-链霉素）冲洗微型储液槽。
7. 将储液槽置于培养皿中，膜面朝上，放置于一滴培养基（600 µL/400 µL）之上。
8. 借助移液器或玻璃毛细管，将分离好的离体胚胎肾脏或肾类器官均匀地排列在膜上，避免肾脏周围残留过多液体。
9. 将样本置于细胞培养孵育箱中（37 °C，5% CO₂），使其在膜上贴附2–24小时。
   注意：在小号小室上最多可排列八个E11.5期小鼠胚胎肾脏或肾类器官。若需移植较大块的胚胎组织，或在CAM上较大区域接种细胞-水凝胶混合物，则建议使用大号小室。
10. 从细胞培养孵育箱中取出按照已发表方法制备的8日龄卵外培养鸡胚。
11. 将微型储液槽转移至CAM上，使移植物面向CAM，膜覆盖其上。将微型储液槽置于CAM的周边区域，避免覆盖鸡胚本体。
    注意：若使用由12孔板Transwell小室制成的小号微型储液槽，每个CAM上最多可放置三个。
12. 向微型储液槽中加入500 µL（6孔小室）或300 µL（12孔小室）培养基。
13. 在鸡胚CAM上最多培养9天，每天更换微型储液槽中的培养基。
    注意：移植后24–48小时内即可观察到样本的血管化现象。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养箱	Panasonic	13090543	温度设定为37° C，湿度90%，5% CO2
细胞培养箱	SANYO	10070347	鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）培养用培养箱。温度设定为37° C，湿度90%，5% CO2
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Sigma	D777	高葡萄糖
乙醇（70%）	VWR
胎牛血清	HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
杜蒙特#5镊子	Dumont	#5SF
不含钙镁离子的磷酸盐缓冲液（PBS -/-）	Corning	20-031-CV
含钙镁离子的磷酸盐缓冲液（PBS +/+）	Biowest	X0520-500	用于清洗微型储液槽
青霉素-链霉素双抗溶液	Sigma	P4333
ThinCert 12孔细胞培养小室，带0.4 µm孔径聚苯乙烯膜	Greiner Bio-One	665641
ThinCert 6孔细胞培养小室，带0.4 µm孔径聚苯乙烯膜	Greiner Bio-One	657610