小脑延髓池手术注射：一种将肿瘤细胞直接注入小鼠中枢神经系统的方法

摘要

来源：Law, V. 等。 一种用于研究软脑膜疾病直接靶向治疗的小鼠奥马耶异种移植模型。J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们介绍了将人源性肿瘤细胞注入小鼠脑池（cisterna magna）的操作步骤。该原位小鼠模型可用于研究癌症向颅脑脑膜的转移扩散过程。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 循环肿瘤细胞的制备

1. 计算注射所需的循环肿瘤细胞（CTC）数量，并在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中制备浓度为 1.0 × 10⁴ 个细胞/μL 的单细胞悬液。整个操作过程中将细胞悬液置于冰上或 4 °C 保存。
   注意：若使用的细胞系需要胰酶消化，请务必用无菌 PBS 洗涤细胞两次以去除胰酶。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。若使用较大规模的动物群体（>50 只小鼠），应在每次注射之间重新计数细胞并验证细胞活力，以确保每只小鼠接受的细胞数量一致。

2. 术前准备

1. 皮下注射布托啡诺缓释剂（Bup-SR），剂量为 5 mg/kg。
   注意：避免在预定切口区域注射；选择远离肩胛骨的注射部位。
2. 使用 2–3% 异氟烷对小鼠进行麻醉，直至其失去翻正反射。此外，通过检查尾部和/或足垫夹捏反射来确认麻醉状态。
3. 在远离手术区域的位置为小鼠准备手术。剃除手术部位（即颅骨背侧）及其周围足够范围的毛发，以防止毛发污染切口区域；然后使用杀菌性皮肤消毒剂由中心向外周擦拭消毒，并待其自然干燥。使用无菌手术巾或带粘性的无菌塑料手术巾覆盖手术区域，以防止污染。
   注意：手术器械需预先高压灭菌，且在不同动物间使用玻璃珠灭菌器对器械尖端进行再消毒。
4. 剃除头部整个腹侧表面的毛发，并采用无菌技术进行皮肤准备。
5. 将小鼠鼻部置于立体定位仪改良的 L 形鼻模中，确保鼻孔保持通畅。用胶带穿过两侧耳廓腹面，轻轻向前牵拉皮肤并固定于鼻模上，固定后使颈部弯曲约 90° 角。给予 1.5% 异氟烷以维持麻醉状态。
   注意：正确体位应使枕骨后缘清晰可见，便于识别切口区域。
6. 调整身体位置，确保脊柱与小脑延髓池保持水平；在轻微牵拉尾巴的同时，用胶带固定尾根部。

3. 小脑延髓池注射手术

1. 将颈部充分伸展，从耳廓之间开始，用手术剪刀尖端沿枕骨向下施加轻微压力进行切割。
   注意： 在此正中位置，当剪刀尖端进入小脑延髓池凹陷区域时，可感觉到一个小的凹陷。
2. 在可触及的凹陷上方做一长约3–5 mm的正中切口。用30 G Hamilton注射器吸取5 μL细胞悬液（浓度为1.0 × 10⁴ 个细胞/μL，共5.0 × 10⁴ 个细胞）。
3. 使用尖端为1–2 mm的钝头镊子轻轻按压小脑延髓池区域。将镊子以闭合状态插入，然后在对硬脑膜施加向下压力的同时打开镊尖。
4. 重复上一步所述的钝性分离操作，直至清晰辨认出硬脑膜，并在暴露区域可见相关血管。
   注意： 形成的注射窗口可确保针头插入时不会损伤血管。
5. 保持镊子张开以牵拉周围肌肉组织，将30 G无芯针头插入硬脑膜下方，观察针尖斜面。确保针头仅插入至斜面稍过的位置。缓慢推动注射器活塞，将细胞注入硬脑膜下方。
6. 正确放置针头斜面，以便观察硬脑膜下的注射过程。操作时应谨慎，使用30 G无芯针头以避免损伤膜结构并尽量减少渗漏。若发现渗漏，可用棉签轻轻按压。
7. 使用伤口夹或微量皮肤黏合剂闭合皮肤切口。注射完成后，将小鼠置于温暖的毯子上恢复麻醉，持续观察直至其能够维持胸卧位并表现出有目的的运动。
8. 术后第一周内每日监测小鼠状况。若小鼠出现疼痛或痛苦表现，根据兽医咨询和指导，每12至24小时皮下注射一次卡洛芬（10 mg/kg），最多连续使用5天。在进行下一步操作前，应让小鼠恢复至少48至72小时。
   注意： 预先给予的缓释布托啡诺（Bup-SR）药效可持续达72小时，通常无需额外镇痛。但如有需要（如小鼠精神萎靡、拒食、毛发竖立等），仍应给予额外镇痛治疗。若手术部位出现术后感染征象（如红肿、压痛、异常痛觉敏感、痛觉过敏、痛觉超敏或化脓），或小鼠表现出保护性行为，应实施安乐死。若癌细胞成功注入脑脊液（CSF），中枢神经系统内的LMD及肿瘤进展将在1至2周内出现（具体时间取决于所使用的CTC类型或细胞系）（图1）。

结果

图1：在小鼠异种移植模型中将循环肿瘤细胞注射至小脑延髓池以研究软脑膜疾病及中枢神经系统转移。（A）示意图显示小脑延髓池的位置及脑脊液穿刺注射部位，使用Hamilton注射器将CTC注入该部位。（B）注射循环肿瘤细胞2周后，发展出软脑膜疾病及中枢神经系统转移（脑部及沿脊髓分布）的小鼠代表性IVIS成像图。细胞标记有荧光素酶报告基因。注射生理盐水的对照组动物未形成肿瘤（n = 3），实验重复三次。缩写：CTCs = 循环肿瘤细胞；IVIS = 活体成像系统。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
珠粒灭菌器 	Braintree Scientific Inc. (或任意供应商) 	#GER 5287-120V 	Germinator 500
缓释布托啡诺（Bup-SR） 	Zoopharm 		美国药品执法局（DEA）管制药品
Hamilton 微量注射器&nbsp;	Hamilton&nbsp;		10、25、50 和 100 &mu;L；<br/> 小脑延髓池注射使用 30G 针头
磷酸盐缓冲液（PBS）&nbsp;	任意供应商		0.1 mm 无菌过滤
啮齿类动物外科手术器械（剪刀、镊子）	Roboz Surgical Instrument（或任意供应商）
无菌蓝色纸巾/铺巾&nbsp;	任意供应商
无菌棉签&nbsp;	任意供应商