小鼠脑室内注射：一种经Ommaya导管向小鼠脑室直接给药的药物递送方法

摘要

来源：Law, V. 等。一种用于研究软脑膜疾病直接靶向治疗的小鼠奥马耶异种移植模型。视觉化实验杂志 (2021)

本视频展示了在小鼠模型中通过奥马耶（Ommaya）介导的脑室内注射技术。该方法可实现潜在药物候选物的局部递送，并避开血脑屏障。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 小鼠Ommaya装置的组装与植入

1. 准备操作台
   1. 对操作台表面进行消毒。在台面上铺上蓝色覆盖物，并将 图1 中所示的所有已灭菌器械和用品准备就绪。
2. 术前准备
   1. 给予镇痛剂（Bup-SR），并维持无菌手术环境。
3. 小鼠奥马雅（Murine Ommaya）装置的手术植入
   1. 使用25G（外径0.51 mm）微型注射端口和1 mm间隔盘组装小鼠奥马雅注射装置。使用氰基丙烯酸盐无菌粘合剂固定，确保金属套管约有2.5 mm深度穿透至右侧大脑半球（图2A–C）。
      注意： 本实验室已开发出一种可兼容MRI的小鼠奥马雅原型装置，其微型注射端口与间隔盘已通过3D打印集成于一体化单元（图2D）。该一体化版本已通过MRI验证，可省去组装步骤，节省操作时间。
   2. 使用2–3%异氟烷麻醉小鼠，直至其翻正反射消失。进一步通过尾部和/或足垫夹捏反射检查，确认麻醉状态。
   3. 剃除头部腹侧全部毛发，并按无菌操作技术进行皮肤准备。将小鼠置于立体定位仪中，通过鼻罩在手术过程中持续给予异氟烷；将异氟烷浓度降至1.5%。轻轻收紧耳杆以固定头部，并涂抹眼用润滑剂保护小鼠眼睛。
   4. 做一小型皮肤切口（3 mm），随后钝性分离皮下组织以暴露颅骨。使用浸有双氧水的棉签轻轻擦拭颅骨表面使其干燥。
   5. 在颅骨上钻孔，钻孔位置位于前囟（bregma）后方0.5 mm、外侧1.1 mm处——前囟是颅骨上冠状缝与矢状缝垂直相交的解剖学标志点（图2A）；另钻一个直径0.9 mm的孔以暴露硬脑膜。移开微型钻头，在插入注射端口前，轻轻划痕钻孔周围骨面，注射端口插入深度约为2.5 mm，并使用氰基丙烯酸盐无菌粘合剂将其固定于颅骨上。在注射部位周围使用4-0非吸收性尼龙缝线，采用间断缝合或荷包缝合法进行缝合固定。
   6. 术后将小鼠单独饲养于独立笼具中以促进恢复。
      注意： 若将多只术后恢复期小鼠共同饲养于同一笼中，小鼠奥马雅装置可能因持续相互干扰行为而脱落。建议在整个药物疗效试验期间，将植入小鼠奥马雅装置的小鼠单独饲养（或每笼不超过2只）。

2. 小鼠Ommaya治疗

1. 使用小鼠Ommaya给药
   1. 用2–3%异氟烷麻醉小鼠，直至其无翻正反射迹象。进一步通过夹捏尾巴和/或脚掌以确认麻醉维持状态。
   2. 使用端口注射适配器和Hamilton注射器接触小鼠Ommaya。用镊子夹住微型注射端口的顶部，将注射端口适配器轻轻完全插入端口的隔膜中。
      注意：注射端口适配器以最小化死腔的方式刺穿端口隔膜，从而可通过电动注射泵实现精确控制的注射（图3A）。在麻醉状态下，以1 µL/min的流速注入靶向/新型治疗药物。根据研究者的判断，在规定的时间间隔（每日/每周）内给予治疗，持续一定时间（数周/数月）。
      ​3至7 µL的给药体积为最佳，因为小于<3 µL的体积不可靠，而大于>7 µL的体积可能造成过高压力。Hamilton注射器的规格可根据每组治疗小鼠的数量选择10至100 µL。预先将适当体积的药物装入Hamilton注射器，可避免重复更换注射器，从而最大限度减少误差。建议每个治疗组专用一支Hamilton注射器。
   3. 完成注射后，用镊子将小鼠Ommaya从注射端口适配器上分离，并将小鼠放回笼中恢复麻醉。

结果

图1：小鼠Ommaya导管植入术工作站设置示例。（1）气体麻醉机/蒸发器。（2）覆盖在立体定位仪支架上的无菌蓝色手术单。（3）立体定位装置（支架/平台、耳杆、鼻部麻醉罩）。（4）微型钻。（5）带光源的放大镜。（6）无菌棉签及盛有无菌生理盐水的冲洗容器。（7）过氧化氢。（8）玻璃珠灭菌器。

图2：小鼠Ommaya装置的植入。（A）示意图，箭头指示颅骨上bregma的位置，以及使用微型钻头在bregma后方0.5 mm...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mm 间隔垫片	Alzet, Durect Corporation	#0008670	仅限间隔垫片
4-0 Ethilon 尼龙缝线	任意供应商
自动注射泵	Harvard Syringe Pumps（或任意供应商）	#70-4505	Pump 11 Elite
珠式灭菌器	Braintree Scientific Inc.（或任意供应商）	#GER 5287-120V	Germinator 500
缓释型布托啡诺（Bup-SR）	Zoopharm		受美国缉毒局管制
氰基丙烯酸酯无菌粘合剂	任意供应商
气体吸入麻醉系统	VeteEquip	#901812	COMPAC5
Hamilton 微量注射器	Hamilton		10、25、50 和 100 &mu;L；<br/> 小脑延髓池注射使用 30G 针头
过氧化氢	任意供应商
IVIS 200 成像系统	Caliper Life Sciences
带光源放大镜	任意供应商
微型钻机	Stoelting（或任意供应商）	#51555M
MRI 成像	Bruker	BioSpec 系列	可选
小鼠 Ommaya（MRI 兼容）原型	Instech Laboratories, Inc.	#VAB620-25MRI-3.3
PinPort 注射器	Instech Laboratories, Inc.	#PNP3M-50
PinPort	Instech Laboratories, Inc.	#1-PNP3F28-50
啮齿类动物外科器械（剪刀、镊子）	Roboz Surgical Instrument（或任意供应商）
立体定位仪	Stoelting（或任意供应商）	#51730M
无菌蓝色纸巾/铺巾	任意供应商
无菌棉签	任意供应商