基于细胞生物发光的检测:一种用于组合药物筛选的高通量方法

Abstract

来源:胡， Z. et al.一种快速筛选工作流程，用于确定使用患者来源的神经胶质瘤干细胞治疗 GBM 的潜在联合疗法。J. Vis. Exp.（2021 年）

在本视频中，我们介绍了一种方法，该方法强调了生物发光测定在灵敏和快速筛选药物方面的效用。这些药物可以单独或联合测试，以评估其作用方式的协同作用。

Protocol

1. 基于生物发光的细胞活力测量

1. 用细胞外基质 （ECM） 混合物（例如，基质胶）包被板:向每个孔中加入 40 μL 0.15 mg/mL ECM 混合物，并在 37 °C 下孵育板 1 小时。去除多余的 ECM 混合物并用 PBS 轻轻冲洗一次。
2. 将含有 15,000、10,000、8,000、6,000、4,000、2,000、1,000 和 500 个 XG387-Luc 细胞的 100 μL 培养基以及 100 μL 空白培养基作为对照加入每个孔中，在 96 孔光学底板中重复 6 次，并在 37 °C 下培养细胞过夜。
3. 去除上清液，向每个孔中加入 50 μL 含有 150 ng/μL D-荧光素的培养基，并在 37 °C 下孵育细胞 5 分钟。
4. 使用 IVIS 光谱成像系统拍摄板中细胞生物发光的图像。使用内置软件创建感兴趣区域 （ROI） 的多个圆形区域并量化细胞生物发光。

2. 替莫唑胺治疗和联合筛查

1. 在处理之前，如上述步骤 1 中所述，预涂四个 96 孔板。
2. 将 XG387-Luc 细胞以 1,000 个细胞的密度在 100 μL 培养基中接种到 96 孔光学底板的每个孔中，并将细胞培养过夜。
3. 提前从储备溶液中制备替莫唑胺和靶向药物。在培养基中制备由 800 μM、600 μM、400 μM、300 μM、200 μM、100 μM 和 50 μM 替莫唑胺组成的浓度系列，用于单药治疗。将替莫唑胺和靶向药物分别稀释在培养基中的储备溶液中，以获得 200 μM 和 2 μM 的最终浓度，用于联合药物筛选（材料列表）。
4. 当大多数 GSC 粘附在板的底部时，取出培养基;将上述制备的含有替莫唑胺的培养基添加到每个孔中，每次处理进行三次技术重复。
5. 为了处理替莫唑胺并筛选药物组合，取出空白培养基，并将上述制备的含有 200 μM 替莫唑胺或 2 μM 靶向剂或两者的组合的培养基加入每个孔中，每次处理进行三次技术重复。
6. 将所有板在 37 °C、5% CO₂ 下孵育 3 天。
7. 取出含药物的培养基，向每个孔中加入 50 μL 含有 150 ng/μL D-荧光素的空白培养基，并在 37 °C 下孵育细胞 5 分钟。
8. 使用 IVIS 光谱成像系统拍摄板中细胞生物发光的图像。使用内置软件创建多个循环 ROI 并量化细胞生物发光。

Materials