基于SEC的分离小胶质细胞来源细胞外囊泡技术：从小胶质细胞条件培养基中分离细胞外囊泡的方法 关键词：SEC，小胶质细胞，细胞外囊泡，条件培养基，分离方法

摘要

来源：Lemaire, Q. 等. 免疫细胞来源的细胞外囊泡的表征及其对细胞微环境功能影响的研究。J. Vis. Exp. (2020)

本视频介绍了一种基于尺寸排阻色谱法（SEC）的方法，用于分离源自脑免疫细胞——小胶质细胞的细胞外囊泡（EVs）。这些细胞外囊泡作为分子载体，可递送调节免疫反应的介质。因此，分离得到的细胞外囊泡可用于构建体外模型，以研究神经免疫反应过程中小胶质细胞与神经元之间的相互作用。

方案

1. 小胶质细胞/巨噬细胞的原代培养

1. 小胶质细胞的原代培养
   1. 将商品化的大鼠原代小胶质细胞（2 × 10⁶ 个细胞）（参见材料表）在添加了10% 无外泌体血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素和9.0 g/L 葡萄糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO₂ 条件下进行培养。
   2. 培养48小时后收集条件培养基，并进行细胞外囊泡（EV）的分离。
2. 巨噬细胞的原代培养
   1. 将商品化的大鼠原代巨噬细胞（1 × 10⁶ 个细胞）在供应商提供的培养基中（参见材料表），添加无外泌体血清，于37 °C、5% CO₂ 条件下培养。
   2. 培养24小时后收集条件培养基，并进行细胞外囊泡（EV）的分离。

2. 细胞外囊泡（EVs）的分离

1. 从条件培养基中预先分离细胞外囊泡（EVs）
   1. 将小胶质细胞或巨噬细胞培养物的条件培养基（步骤 1.1.2 或 1.2.2）转移至锥形管中。
   2. 在室温（RT）下以 1,200 × g 离心 10 分钟，沉淀细胞。
   3. 将上清液转移至新的锥形管中，在室温下以 1,200 × g 离心 20 分钟，以去除凋亡小体。
   4. 将上清液转移至 10.4 mL 聚碳酸酯管中，并将该管放入 70.1 Ti 转子中。在 4 °C 下以 100,000 × g 超速离心 90 分钟，沉淀 EVs。
   5. 弃去上清液，将含有 EVs 的沉淀重悬于 200 μL 经 0.20 μm 滤膜过滤的磷酸盐缓冲液（PBS）中。
2. EVs 的分离
   1. 自制尺寸排阻色谱柱（SEC）的制备
      1. 取一支空玻璃色谱柱（长度：26 cm；直径：0.6 cm）（见材料表），清洗并灭菌。
      2. 在色谱柱底部放置一个 60 μm 滤膜。
      3. 用交联琼脂糖凝胶过滤基质填充色谱柱，形成直径为 0.6 cm、高度为 20 cm 的固定相。
      4. 用 50 mL 经 0.20 μm 滤膜过滤的 PBS 冲洗固定相。如需后续使用，可储存于 4 °C。
   2. 将重悬后的 EV 沉淀加至 SEC 柱固定相顶部。
   3. 在持续向固定相顶部添加经 0.20 μm 滤膜过滤的 PBS 以防止柱体干燥的同时，依次收集 20 个 250 μL 的组分。如有需要，将组分储存于 -20 °C。
      注意：若需储存超过一周，建议储存于 -80 °C，以保持 EV 的完整性，用于后续分子分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
大鼠巨噬细胞 &和小胶质细胞培养基	细胞应用	R620K-100	细胞来源：正常健康大鼠 骨髓
大鼠原代小胶质细胞	Lonza	RG535
Sepharose CL-2B	GE Healthcare	17014001
超速离心	Beckman Coulter	A95765
超速离心转子 70.1 Ti	Beckman Coulter	342184
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8769
磷酸盐缓冲液	英杰公司	14190094	无钙，无镁
聚碳酸酯离心管	Beckman Coulter	355651
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
Exo-FBS	Ozyme	EXO-FBS-50A-1	无外泌体胎牛血清
DMEM Gibco 41966029
离心	Eppendorf	5804000010
CO2 培养箱	ThermoFisher
pluriStrainer M/ 60 μm	pluriSelect	43-50060
MonoP FPLC 柱	GE Healthcare		暂无可用内容