基于 SEC 的小胶质细胞衍生的细胞外囊泡分离:一种从小胶质细胞条件培养基中分离细胞外囊泡的技术

Abstract

来源:Lemaire， Q. et al.免疫细胞衍生的细胞外囊泡的表征和研究对细胞环境的功能影响。J. Vis. Exp.（2020 年）

该视频介绍了一种基于尺寸排阻色谱 （SEC） 的方法，用于分离源自脑免疫细胞（小胶质细胞）的细胞外囊泡或 EV。EV 充当分子货物，传递调节免疫反应的介质。因此，分离的 EV 可用作体外模型，以研究神经元免疫反应期间的小胶质细胞-神经元串扰。

Protocol

1. 小胶质细胞/巨噬细胞的原代培养

1. 小胶质细胞的原代培养
   1. 在补充有 10% 无外泌体血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素和 9.0 g/L 葡萄糖的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中培养商业大鼠原代小胶质细胞（2 x 10⁶ 个细胞）（参见材料表），在 37 °C 和 5% CO₂ 下。
   2. 培养 48 小时后收集条件培养基，然后进行 EV 的分离。
2. 巨噬细胞的原代培养
   在
   1. 制造商提供的培养基（参见材料表）中，在 37 °C 和 5% CO₂ 下培养商业大鼠原代巨噬细胞（1 x 10⁶ 个细胞），不含外泌体血清。
   2. 培养 24 小时后收集条件培养基，然后进行 EV 的分离。

2. EV 的隔离

1. 从条件培养基中预分离 EV
   1. 将小胶质细胞或巨噬细胞培养物中的条件培养基（步骤 1.1.2 或 1.2.2）转移到锥形管中。
   2. 在室温 （RT） 下以 1,200 x g 离心 10 分钟以沉淀细胞。
   3. 将上清液转移到新的锥形管中。在 RT 下以 1,200 x g 离心 20 分钟以消除凋亡小体。
   4. 将上清液转移至 10.4 mL 聚碳酸酯管中，然后将管转移至 70.1 Ti 转子中。在 4 °C 下以 100,000 x g 超速离心 90 分钟以沉淀 EV。
   5. 弃去上清液，将含有 EV 的沉淀重悬于 200 μL 的 0.20 μm 过滤磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。
2. 电动汽车的隔离
   1. 自制体积排阻色谱柱 （SEC） 的制备
      1. 清空玻璃色谱柱（长度:26 cm;直径:0.6 cm）（参见材料表），清洗和消毒。
      2. 在色谱柱底部放置一个 60 μm 过滤器。
      3. 用交联琼脂糖凝胶过滤基质堆叠色谱柱，以产生直径为 0.6 cm、高度为 20 cm 的固定相。
      4. 用 50 mL 的 0.20 μm 过滤 PBS 冲洗该相。储存在 4 °C 以备后用。
   2. 将重悬的 EV 沉淀置于 SEC 色谱柱固定相的顶部。
   3. 收集 20 个 250 μL 的连续馏分，同时继续在固定相顶部添加 0.20 μm 过滤的 PBS，以防止色谱柱干燥。如有必要，将馏分储存在 -20 °C><。 注意: 可以在 -80 °C 下进行超过一周的储存，以保持分子分析的 EV 完整性。

Materials