基于SDS-PAGE的细胞外囊泡相关蛋白提取：一种从细胞外囊泡中提取蛋白并进行凝胶内消化前处理的方法

摘要

来源：Lemaire, Q. 等 免疫细胞来源的细胞外囊泡的表征及其对细胞微环境功能影响的研究。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们演示了用于从细胞外囊泡（EVs）中提取蛋白质的SDS-PAGE胶内消化方法。分离后获得的蛋白质片段可用于蛋白质组学分析。

方案

1. 细胞外囊泡（EVs）的表征

1. Western印迹分析
   1. 蛋白质提取
      1. 通过尺寸排阻色谱柱（SEC）分离细胞外囊泡（EVs），并使用纳米颗粒追踪分析（NTA）进行定量。
      2. 将50 μL RIPA裂解缓冲液（150 mM 氯化钠 [NaCl]，50 mM Tris，5 mM 乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸 [EGTA]，2 mM 乙二胺四乙酸 [EDTA]，100 mM 氟化钠 [NaF]，10 mM 焦磷酸钠，1% Nonidet P-40，1 mM 苯甲基磺酰氟 [PMSF]，1×蛋白酶抑制剂）与EV样品（25 μL，来自滤膜浓缩后的EV）混合，在冰上孵育5分钟以提取蛋白质。
      3. 在冰上进行超声处理，每次5秒（振幅：500 W；频率：20 kHz），重复3次。
      4. 在4 °C条件下，以20,000 × g 离心10分钟，去除囊泡碎片。
      5. 收集上清液，并采用Bradford蛋白定量法测定蛋白浓度。
   2. 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）与Western印迹
      1. 将蛋白提取物（30 μg）与5倍体积的Laemmli上样缓冲液（v/v）混合。
      2. 将蛋白混合液上样至12%聚丙烯酰胺凝胶。
      3. 使用TGS电泳缓冲液（25 mM Tris pH 8.5，192 mM 甘氨酸，0.1% SDS）进行电泳，先以70 V运行15分钟，再以120 V运行45分钟。
      4. 采用半干转系统，在230 V条件下将蛋白转移至硝酸纤维素膜30分钟。
      5. 在室温下，用封闭缓冲液（0.05% Tween 20 w/v，5% 脱脂奶粉 w/v 溶于0.1 M PBS，pH 7.4）封闭膜1小时。
      6. 将膜在4 °C下与小鼠单克隆抗人热休克蛋白90（HSP90）抗体在封闭缓冲液中稀释（1:100）后孵育过夜。
      7. 用PBS-Tween缓冲液（PBS，0.05% Tween 20 w/v）洗涤膜3次，每次15分钟。
      8. 在室温下，将膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗在封闭缓冲液中稀释（1:10,000）后孵育1小时。
         ​注意：阴性对照使用二抗单独孵育。
      9. 重复洗涤步骤（步骤1.1.2.7）。
      10. 使用增强型化学发光（ECL）Western印迹检测试剂盒显影膜（参见材料表）。

2. 蛋白质组学分析

1. 蛋白质提取与凝胶内消化
   1. 通过尺寸排阻色谱柱（SEC）分离细胞外囊泡（EVs），并采用纳米颗粒追踪分析（NTA）进行定量。重复步骤1.1.1以提取EV蛋白。
   2. 在12%聚丙烯酰胺凝胶的浓缩胶中进行蛋白质电泳迁移。
   3. 在室温下用考马斯亮蓝固定凝胶中的蛋白质，持续20分钟。
   4. 将每块有色凝胶切除，并切成约1 mm的小块³.
   5. 依次用以下溶液各 300 μL 洗涤凝胶条带：超纯水洗涤 15 分钟，100% 乙腈（ACN）洗涤 15 分钟，100 mM 碳酸氢铵（NH₄HCO₃) 15分钟，乙腈：100 mM NH₄HCO₃ (1:1，v/v) 溶液中孵育15分钟，再用100%乙腈处理5分钟，持续搅拌。
   6. 使用真空浓缩仪将凝胶碎片完全干燥。
   7. 使用100 μL 100 mM NH进行蛋白质还原₄HCO₃ 含10 mM二硫苏糖醇，56°C孵育1小时。
   8. 使用100 μL 100 mM NH进行蛋白质烷基化₄HCO₃ 含 50 mM 碘乙酰胺，室温避光孵育 45 分钟。
   9. 依次用以下溶液各 300 μL 洗涤凝胶条：100 mM NH₄HCO₃、50% 乙腈/50 mM NH₄HCO₃，然后用 100% 乙腈洗涤。₄HCO₃ 15 分钟，乙腈：20 mM NH₄HCO₃₄HCO₃ (1:1，v/v) 溶液中搅拌反应15分钟，再用100%乙腈处理5分钟，持续搅拌。
   10. 使用真空浓缩仪将凝胶小块完全干燥。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙腈	Fisher Chemicals	A955-1
碳酸氢铵	Sigma-Aldrich	9830
HSP90 α/β 抗体 (RRID: AB_675659)	Santa-cruz	sc-13119
Bio-Rad 蛋白检测试剂浓缩液（Bradford）	Bio-Rad	5000006
二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	43819
乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸′′	Sigma-Aldrich	03777-10G
乙二胺四乙酸	Sigma-Aldrich	ED-100G
Fisherbrand Q500 探头式超声破碎仪	Fisherbrand	12893543
碘乙酰胺	Sigma-Aldrich	I1149
InstantBlue 考马斯亮蓝蛋白染色液	Expedeon	ISB1L
Laemmli 2x	Bio-Rad	1610737
Nonidet P-40	Fluka	56741
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-003
鬼笔环肽-四甲基罗丹明偶联物	Santa-cruz	sc-362065
蛋白酶抑制剂	Sigma-Aldrich	S8830-20TAB
氯化钠	Scharlau	SO0227
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	L3771
氟化钠	Sigma-Aldrich	S7920-100G
焦磷酸钠	Sigma-Aldrich	S6422-100G
SpeedVac 真空浓缩仪	ThermoFisher
Trans-Blot SD 半干式转膜仪	Bio-Rad	1703940