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所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 活体成像
注意： 肿瘤细胞注射与首次活体成像之间的时间间隔取决于所使用的肿瘤细胞系类型。本方案所示实验中，注射了 1×105 GL261 细胞，并在 10 天后进行成像。
- 成像准备
- 通过面罩吸入麻醉（1.5%–2% 异氟烷/O2 混合气体）使小鼠镇静。
- 皮下注射 100 µL 生理盐水，以防止脱水。
注意：对于长期成像，可通过皮下输液泵对小鼠进行补水。
- 将小鼠仰卧置于成像盒中。使用一个直径为 1 mm 的孔洞并在孔周围嵌入小磁铁的金属板，将颅窗（CIW）固定在成像盒上。通过面罩输入异氟烷，并在盒子另一侧设置排气口（0.8%–1.5% 异氟烷/O2 混合气体）。可选地，使用胶带固定小鼠身体。
注意：此时可静脉注射荧光标记的葡聚糖以显示血管，或其他染料。
- 可选地，使用脉搏血氧仪和加热探头监测小鼠的生命体征。
注意：本实验中未使用脉搏血氧仪和加热探头，因为小鼠在整个成像期间（2–3 小时）状态稳定。但对于更长时间的成像，可能需要更全面的监测。
- 将 25 倍水浸物镜（例如 HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 mm）调至最低的 z 位置，并滴加一大滴水。
注意：对于长期实验，强烈建议使用水浸式微量加样器，因为它允许在实验过程中补充水分。也可使用干式物镜。
- 将成像盒转移至配备黑暗恒温培养室（保持在 37 °C）的显微镜上。移动物镜直至水滴接触颅窗盖玻片。
- 使用落射荧光模式，通过目镜观察肿瘤，并将细胞调至清晰对焦。
2. 时间序列图像采集
- 选择多个感兴趣的成像位置，并在软件中记录其坐标。确保所选位置能代表肿瘤不同区域的典型位置（每个肿瘤可能不同，但为保证一致性，需在所有小鼠中选择相同数量的肿瘤核心中央及边缘位置）。
注意：可对肿瘤的一部分或整个可见肿瘤进行拼接扫描；然而，若肿瘤较大，此方法将增加图像间的时间间隔。此外，若肿瘤细胞移动较快，可能难以在长时间内追踪同一细胞。
- 切换至多光子模式，并将激光调至合适的波长。注意，为避免光损伤，应优先使用较长的波长。
注意：在Dendra2成像中，使用了960 nm的波长。结合本实验所用物镜，1.3倍的缩放倍数足以获得良好的肿瘤细胞核分辨率，并扫描肿瘤的代表性区域。
- 进入实时成像模式，为每个位置定义一个 z-堆栈，以在不降低肿瘤细胞分辨率的前提下获取最大体积的肿瘤细胞图像。将图像间的步长设为3 µm。
- 使用双向扫描模式以提高扫描速度。图像分辨率应至少为512 × 512像素。
- 每20分钟对不同位置的肿瘤体积进行一次图像采集，持续2小时。每次图像采集前需在物镜上添加水。
注意：可通过在软件中设置合适的时间间隔，自动采集延时图像。然而，小鼠可能发生移动，导致成像位置或 z-堆栈随时间发生偏移，造成数据丢失。因此，建议手动进行延时成像，并在每次采集之间检查和校正 xyz 方向的位移。
- 在此步骤中，可选择性地对Dendra2荧光标记进行光转换。
注意：与延时成像（可用于研究单个肿瘤细胞的特性及其随时间的变化）不同，此操作可用于研究肿瘤细胞在脑内浸润区域的变化，时间跨度可达数天。