基于荧光的Transwell巨噬细胞趋化实验：一种通过化学诱导趋化作用研究肿瘤-巨噬细胞相互作用的体外方法

摘要

来源：An, Z. 等 研究肿瘤-巨噬细胞相互作用的体外实验方法。 J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们采用基于荧光的Transwell巨噬细胞相互作用实验来研究肿瘤细胞与巨噬细胞之间的相互作用。 该实验通过化学诱导的趋化作用，分析巨噬细胞的迁移行为。

方案

1. 体外巨噬细胞趋化实验

1. 条件培养基的制备

1. 将肿瘤细胞维持培养基置于37 °C水浴中预热20分钟。
2. 用70%乙醇喷洒组织培养超净台表面，并用纸巾擦拭去除表面的70%乙醇。从冰箱中取出细胞解离溶液。将培养基瓶和细胞解离溶液瓶用70%乙醇喷洒，再用纸巾擦拭瓶身表面，然后放入组织培养超净台内。
3. 从培养箱中取出6孔板。小心地用移液器将条件培养基转移至15 mL无菌离心管中，将离心管置于冰上。将“仅含培养基” 孔中的培养基移入另一支15 mL无菌离心管中。
   注意： 在此步骤前，务必在显微镜下检查细胞是否已贴壁。若未贴壁，可使用包被板以促进贴附，或在细胞计数步骤中包含悬浮细胞。
4. 向6孔板的每个孔中加入0.5 mL细胞解离溶液。每隔1分钟检查一次肿瘤细胞是否变圆。一旦观察到肿瘤细胞变圆，轻轻敲击孔板侧壁以帮助细胞脱落。
5. 向孔中加入2.5 mL肿瘤细胞维持培养基，上下吹打3次混匀，然后将细胞悬液转移至15 mL无菌离心管中。取10 μL细胞悬液与10 μL台盼蓝溶液混合。吸取10 μL混合液加入细胞计数板，使用自动细胞计数仪测定活细胞数量。
6. 根据细胞数量，使用无血清干细胞培养基调整条件培养基的体积（37 °C孵育过夜）。例如，若A孔的活细胞数量是细胞最少孔的3倍，则将其条件培养基按1:3稀释。此步骤用于校正因细胞增殖速率不同所导致的差异。
   注意： 使用无血清干细胞培养基并在37 °C孵育过夜的原因是控制培养基因长时间暴露于37 °C而可能发生的成分变化。
7. 用0.45 μm滤膜过滤条件培养基。将过滤后的条件培养基置于冰上。
   注意： 此步骤可去除条件培养基中的细胞及细胞碎片。

2. MV-4-11 细胞的制备

1. 将不含FBS的IMDM培养基置于37 °C水浴中预热20分钟。
2. 用70%乙醇喷洒组织培养超净台表面，并用纸巾擦拭去除表面的70%乙醇。将培养基瓶用70%乙醇喷洒后，同样用纸巾擦拭瓶身，然后放入组织培养超净台内。
3. 将MV-4-11细胞培养瓶放入组织培养超净台中。用移液器吸取10 mL细胞悬液至15 mL无菌离心管中。取10 μL细胞悬液与10 μL台盼蓝溶液混合。吸取10 μL混合液加入细胞计数板，使用自动细胞计数仪测定活细胞数量。在4 °C条件下，以200 × g 离心5分钟，弃去上清液。
4. 用10 mL PBS重悬细胞，在4 °C条件下以200 × g 离心5分钟，弃去上清液。
5. 用不含FBS的IMDM培养基重悬细胞，调整终浓度为1×10⁶ 个细胞/mL。
   注意： 此处所用巨噬细胞的数量可根据需要进行调整。

3. Transwell 实验

注意： 对于此步骤，可使用细胞迁移检测试剂盒，或单独购买试剂和小室。对于 MV-4-11 细胞，选择孔径为 5 μm 的 Transwell 小室。为检测巨噬细胞迁移，可直接定量下室中的巨噬细胞数量，或采用比色法/荧光法检测。此处我们以比色法为例演示该实验。

1. 将24孔板、插入式培养小室及试剂置于室温。
2. 将上述制备的MV-4-11细胞各250 μL加入每个插入式培养小室中。
3. 向24孔板的下室中加入400 μL条件培养基或仅普通培养基（于37 °C孵育过夜，作为阴性对照）。每种肿瘤细胞系或对照组均设三个复孔。避免插入式培养小室与条件培养基之间产生气泡，气泡会抑制巨噬细胞向底部孔室迁移。
4. 将培养板置于37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育4小时。
   注意： 孵育时间可根据需要调整。可在显微镜下观察到迁移至下室的细胞。
5. 轻轻敲击插入式培养小室的内壁以松动，随后弃去小室。由于MV-4-11细胞为悬浮生长，此处无需使用细胞解离液或胰蛋白酶处理。
6. 用移液器轻柔吹打孔中细胞3次以混匀。取225 μL细胞悬液转移至适用于荧光检测的黑色壁96孔板中。
7. 用4倍裂解缓冲液将CyQuant染料按1:75稀释。短暂涡旋振荡后离心收集溶液。向每孔96孔板中加入75 μL稀释后的染料溶液，室温孵育15分钟。
8. 使用荧光酶标仪，设置激发波长480 nm、发射波长520 nm进行荧光检测。
9. 通过减去空白值并相对于对照肿瘤细胞系进行归一化处理来分析数据。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mL 血清移液管	奥林巴斯塑料制品	12-104
15 mL 无菌离心管	奥林巴斯塑料制品	28-103
1 mL 移液器吸头	ART分子生物制品	2779-RI
2 mL 吸液移液管	Falcon	357558
24孔板	Millipore	ECM507	ECM507 的一部分，或可 单独购买
4x 裂解缓冲液	Millipore	ECM507	ECM507 的一部分，或可 单独购买
5 μm Transwell 小室	默克密理博	ECM507	ECM507 的一部分，或可 单独购买
Accutase	创新细胞技术	AT-104
B27	Gibco	12587-010
CyQuant染料	Millipore	ECM507	ECM507 的一部分，或可 单独购买
DMEM	Gibco	11965-092
DMEM:F12	Gibco	10565-018
EGF	Peprotech	AF-100-15
FBS	Gibco	26140
FGF	Peprotech	100-18B
IMDM	Gibco	12440-053
PBS	Gibco	14190-144
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
台盼蓝	伯乐（Biorad）	1450021