细胞外囊泡提取：利用差速离心法从完整组织样本中分离细胞外囊泡的技术 关键词：细胞外囊泡，差速离心，组织样本，分离技术，生物标志物，液体活检

摘要

来源：Hurwitz, S. N. 等. 从完整组织中提取细胞外囊泡. 视觉化实验杂志 (2019)

本视频介绍了从新鲜或冷冻组织中提取细胞外囊泡的技术。分离得到的细胞外囊泡可用于进一步分析，以揭示其在疾病发病机制中的重要作用。

方案

1. 组织解离与差速离心

1. 为约 0.4–1.0 g 组织准备 10 mL 解离缓冲液（含 10 mg 木瓜蛋白酶；5.5 mM L-半胱氨酸；67 µM 2-巯基乙醇；1.1 mM EDTA），用 Hibernate-E 培养基配制。
   注意：用于 EV 富集和纯化的所有溶液均应使用超纯过滤水稀释。
2. 将新鲜或冷冻的完整组织加入 50 mL 锥形管中的解离缓冲液内，于 37 °C 水浴中孵育 20 分钟。如有需要，可在孵育前将组织切成更小的片段。
3. 孵育结束后，向含有组织的解离缓冲液中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，使其终浓度为 1×。
4. 将含组织的溶液倒入松配合的 Dounce 匀浆器中，每份样品轻轻匀浆约 30 次慢速冲捣。可根据组织的一致性调整冲捣次数。
5. 将解离后的组织连同缓冲液转移至 50 mL 锥形管中，在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，以沉淀细胞及残留的纤维或凝聚性组织碎片。
6. 将上清液转移至洁净的 50 mL 锥形管中，在 4 °C 条件下以 2,000 × g 离心 10 分钟，以沉淀并弃除大细胞碎片。
7. 再次将上清液转移至洁净的 50 mL 锥形管中，在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 40 分钟，以沉淀不需要的较大囊泡或小型凋亡小体。
   注意： 如有需要，该沉淀物可保存用于进一步研究较大囊泡。
8. 通过 0.45 µm 滤器将上清液倾注至洁净的 12 mL 超速离心管中。
   注意： 致密纤维化组织样本可能难以过滤。此类样本可先通过 40 µm 细胞筛过滤，再依次通过更细的针头（18 G、20 G、22 G）处理，最后再经 0.45 µm 滤器过滤。
9. 在 4 °C 条件下以 100,000 × g 超速离心 2 小时，以沉淀小细胞外囊泡（EVs）。
10. 倒出上清液，并将超速离心管倒置放置 5–10 分钟，频繁轻敲以去除管壁残留液体。也可使用抽吸式真空移液器吸除残余液体。
11. 用 1.5 mL 0.25 M 蔗糖缓冲液（10 mM Tris，pH 7.4）重悬 EV 沉淀。此步骤中必须确保沉淀完全重悬。为此，可在涡旋前用封口膜封住管口，以防止溅出。将超速离心管在室温下轻轻摇动 15–20 分钟，最后再进行一次涡旋混匀。
12. 短暂离心，速度不超过 1,000 × g ，使液体悬浮物沉降至管底。
13. 继续进行下述梯度纯化步骤；如需，可将 EV 悬浮液在 4 °C 下短期保存过夜。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.45 µm 滤膜	VWR	28145-505
12 mL 超速离心管	Beckman Coulter	331372
5.5 mL 超速离心管	Beckman Coulter	344057
HALT 磷酸酶抑制剂（100 倍溶液）	ThermoFisher Scientific	78420
HALT 蛋白酶抑制剂（100 倍溶液）	ThermoFisher Scientific	78438
Hibernate E 培养基	ThermoFisher Scientific	A1247601
MLS-50 摆桶转子	Beckman Coulter	367280
Optima MAX-XP 台式超速离心机	Beckman Coulter	393315