细胞外囊泡亚群的纯化：利用密度梯度超速离心法纯化细胞外囊泡亚群的技术

摘要

来源：Urwitz, S. N. 等。从完整组织中提取细胞外囊泡。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了基于密度梯度超速离心的纯化方法，用于分离适合进行表征研究的细胞外囊泡亚群。

方案

1. 密度梯度纯化

1. 向含有细胞外囊泡（EVs）的1.5 mL蔗糖/Tris缓冲液中加入1.5 mL 60%碘克沙醇（水中的储存液），配制成终浓度为30%碘克沙醇的溶液。反复吹打数次以充分混匀溶液。
   注意：操作时需小心避免移液枪头中残留溶液，因高浓度碘克沙醇黏度较高。
2. 将含有EVs的30%碘克沙醇缓冲液转移至5.5 mL超速离心管底部。
3. 使用60%碘克沙醇储存液，在超纯水中为每个样品至少配制1.5 mL的20%和10%碘克沙醇溶液。
4. 量取1.3 mL 20%碘克沙醇溶液，使用注射器和18 G针头小心地将其叠加在底部梯度层上方。为避免在密度界面处发生混合，应使针头斜面紧贴超速离心管内壁并位于弯月面稍上方，缓慢逐滴加入溶液。
5. 采用与上述相同的技术，将1.2 mL 10%碘克沙醇溶液叠加在20%碘克沙醇层上方。
6. 小心平衡并装载超速离心管至转子吊桶中，在4 °C条件下以268,000 × g 离心50分钟。将离心机的加速和减速速度设置为允许的最低速率，以防止破坏密度梯度层。
7. 为每个样品标记十个1.5 mL微量离心管，对应密度梯度的第1至第10组分。第1组分为最上层组分，将首先被移除；第10组分为最底层组分，最后被移除。
8. 密度梯度超速离心完成后，轻轻将离心管从转子吊桶中取出并置于稳定的支架中。目标组分中通常可见一条明显的囊泡条带。从梯度顶部开始，用移液器依次收集十份490 µL的组分至相应标记的离心管中。管底将残留少量液体，可能含有污染性蛋白质。该部分可弃去，或根据需要保留作为第11组分。
9. 使用折射仪测定各组分的折射率。若需节约样本，也可同时平行运行一个对照梯度进行测量。将每份含碘克沙醇的组分取20–30 µL滴加至折射仪表面，并通过将测得的折射率与已知碘克沙醇密度进行比对，估算其密度。
   注意：如需在进入下一步超速离心洗涤前暂时保存，组分可在含碘克沙醇的溶液中于4 °C保存过夜。
10. 将每份组分转移至洁净的12 mL超速离心管中。向管中加入5 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS；137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO₄，2 mM KH₂PO₄，pH 7.4），并通过缓慢吹打混匀。
    注意： 加入样品的PBS应无颗粒，可通过将无菌PBS经0.22 µm滤膜过滤，并在室温下储存以避免盐析出。
11. 再向管顶加入额外6 mL 1× PBS，并再次小心混匀。
12. 在4 °C条件下以100,000 × g 超速离心2小时，以重新沉淀小囊泡。离心后弃去上清液，轻拍管壁使残留液体干燥，随后可进行囊泡裂解用于蛋白质分析，或重新悬浮EVs用于形态学分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.45 µm 滤膜	VWR	28145-505
12 mL 超速离心管	Beckman Coulter	331372
5.5 mL 超速离心管	Beckman Coulter	344057
FA-45-6-30 转子	Eppendorf	5820715006
MLS-50 摆桶转子	Beckman Coulter	367280
Optima MAX-XP 台式超速离心机	Beckman Coulter	393315
Optima XE-100 超速离心机	Beckman Coulter	A94516
Optiprep	Sigma	D1556	60% 碘克沙醇无菌水溶液
Refracto 30PX（折射仪）	Mettler Toledo	51324650
S-4-104 转子	Eppendorf	5820759003
SW 41 Ti 摆桶转子	Beckman Coulter	333790
台式 5804R 离心机	Eppendorf	22623508