从外周血单个核细胞（PBMNCs）生成诱导性神经干细胞（iNSCs）：一种基于仙台病毒的将PBMNCs重编程为iNSCs的操作流程

摘要

来源：Zheng, W. 等 利用外周单个核细胞生成诱导性神经干细胞并分化为多巴胺能神经元前体细胞用于移植研究 J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了利用仙台病毒将外周血单个核细胞（PBMNCs）重编程为诱导性神经干细胞（iNSCs）的方法。仙台病毒是一种非整合型病毒，可作为一种高效且安全的细胞重编程载体。

方案

1. 通过SeV感染将外周血单个核细胞重编程为诱导性神经干细胞

1. 溶液与培养基的制备
   1. 通过将100 mg多聚-D-赖氨酸（PDL）溶于100 mL H₂O 至浓度为 1 mg/mL。在 -20 °C 下以 1 mL 分装保存。
   2. 将100 mg胰岛素溶解于20 mL 0.01 N HCl中，配制成5 mg/mL的胰岛素储备液。分装为每份1 mL，于-20 °C保存。
   3. 配制 200 mL iNSC 基础培养基，需混合 96 mL DMEM-F12 和 96 mL 基础培养基（材料表加入2 mL 100倍谷氨酰胺储存液、2 mL非必需氨基酸（NEAA）、2 mL N2添加剂和2 mL B27添加剂。使用前添加10 ng/mL重组人白血病抑制因子、3 μM CHIR99021和2 μM SB431542。过滤培养基并于4 °C保存。
      注意： 在2周内使用该培养基。使用前立即加入重组人白血病抑制因子、CHIR99021和SB431542。
2. 通过SeV感染将外周血单个核细胞重编程为诱导性神经干细胞
   1. 使用前对超净台进行紫外线灭菌。用75%酒精对所有表面和设备进行消毒。所有枪头通过高压灭菌器灭菌。
   2. 第0天，收集MNC培养基中的细胞，转移至15 mL锥形管中。以200 x g离心细胞 g 孵育5分钟。吸除上清液，用1 mL预热的MNC培养基重悬细胞。
   3. 用台盼蓝计数活细胞。用预热（37 °C）的MNC培养基重悬细胞，调整细胞浓度至2 x 10⁵ 每孔细胞数，24孔板
   4. 从-80 °C保存条件下取出SeV管后，将含有SeV的管子置于37 °C水浴中解冻5–10秒，随后在室温下继续解冻。解冻完成后，立即置于冰上。
   5. 加入编码人源的SeV Klf4、Oct3/4、SOX2 和 c-MyC 向孔中加入，感染复数（MOI）为10。将细胞与培养板在1,000 x g 孵育30分钟以促进细胞贴壁。将细胞和上清液保留在培养板中，将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中₂.
      警告所有涉及SeV的操作均须在生物安全柜中进行，使用过的枪头和离心管在丢弃前应使用乙醇或次氯酸钠处理。
   6. 第1天，将培养基和细胞转移至15 mL离心管中。用1 mL MNC培养基冲洗孔板。将细胞悬液在200 x g 孵育5分钟。吸除上清液，将细胞重悬于24孔板中，每孔加入500 μL新鲜预热的MNC培养基。
      注意： 使用低吸附24孔板，以防止细胞在接种到PDL/层粘连蛋白之前发生贴壁。
   7. 第2天，将1 mL浓度为1 mg/mL的PDL与19 mL D-PBS混合，稀释至终浓度为50 μg/mL。用50 μg/mL的PDL在室温下孵育6孔板，至少包被2小时。
   8. 将200 μL浓度为0.5 mg/mL的层粘连蛋白与20 mL D-PBS混合，稀释至终浓度为5 µg/mL。吸除6孔板中的PDL溶液，于垂直洁净台中干燥。
   9. 用 5 μg/mL 层粘连蛋白包被 6 孔板，在 37°C 孵育 4–6 小时。使用前用 D-PBS 洗涤。
   10. 第3天，接种在之前步骤中获得的转导细胞 步骤 1.2.6 在多聚赖氨酸/层粘连蛋白包被的6孔板中的iNSC培养基中。   
       注意： 若需移动，在将细胞置于PDL/层粘连蛋白包被的培养板后应轻柔操作，尽量避免干扰细胞的贴附。
   11. 第5天，向6孔板的每个孔中轻柔加入1 mL预热至37 °C的iNSC培养基。 
       注意： 预计细胞将发生显著死亡（>60%).
   12. 第7天，向6孔板的每个孔中轻柔加入1 mL预热至37 °C的iNSC培养基。
   13. 从第9天到第28天，每天更换为新鲜的预热（37 °C）iNSC培养基。观察iNSC克隆的出现情况。约2至3周后，挑选并转移iNSC克隆进行扩增。使用灼烧过的玻璃移液管挑选具有适当形态的克隆，排除可能的污染细胞，并用200 μL吸头吸取克隆。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B27添加剂	Invitrogen	17504044
CHIR99021	Gene Operation	04-0004
DMEM-F12	Gibco	11330
DMEM-F12	Gibco	11320
层粘连蛋白	Roche	11243217001
N2添加剂	Invitrogen	17502048
NEAA	Invitrogen	11140050	非必需氨基酸
Neurobasal	Gibco	10888	基础培养基
PDL	Sigma-Aldrich	P7280	聚-D-赖氨酸
SB431542	Gene Operation	04-0010-10mg	避光保存于-20?
仙台病毒	Life Technologies	MAN0009378
胰岛素	Roche	12585014
24孔板	Corning	3337
15 ml锥形管	Corning	430052
6孔板	Corning	3516
EPO	Peprotech	100-64-50UG	人促红细胞生成素
人白血病抑制因子	Millpore	LIF1010
人重组SCF	Peprotech	300-07-100UG
IGF-1	Peprotech	100-11-100UG	人胰岛素样生长因子
IL-3	Peprotech	200-03-10UG	人白细胞介素3
地塞米松	Sigma-Aldrich	D2915-100MG
IMDM	Gibco	215056-023	伊氏改良杜尔贝科培养基
胰岛素	Roche	12585014
ITS-X	Invitrogen	51500-056	胰岛素-转铁蛋白-硒-X添加剂
GlutaMAX	Invitrogen	21051024	100 × 谷氨酰胺储备液
Ham's-F12	Gibco	11765-054
1-硫代甘油	Sigma-Aldrich	M6145	吸入和皮肤接触有毒
抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A92902	皮肤接触有毒
无血清替代物	Gibco	10828028	无血清基础培养基
化学成分明确的脂质浓缩液	Invitrogen	11905031
转铁蛋白	R&D Systems	2914-HT-100G
台盼蓝	Gibco	T10282