循环游离DNA（cfDNA）的分离：一种基于二氧化硅膜的方法从癌症患者血浆中提取cfDNA 关键词：循环游离DNA，cfDNA，血浆，癌症，二氧化硅膜，提取

摘要

来源：Palande, V. 等. 癌症患者血浆样本中游离DNA的检测。J. Vis. Exp. (2020)

本视频介绍了一种基于二氧化硅膜的方法，用于从人血浆样本中分离循环游离DNA（cfDNA）。cfDNA是癌症诊断和评估的一种有前景的生物标志物。 

方案

所有涉及人类受试者的实验程序均按照机构、国家及国际有关人类福利的指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审核。

1. 从 1 mL 血浆中纯化循环游离 DNA

注意：此步骤使用商业试剂盒进行（参见材料表）。所有缓冲液均由试剂盒提供。

1. 缓冲液和试剂的准备
   注意：切勿将酸性溶液或漂白剂直接加入样本制备废液中。裂解缓冲液、结合缓冲液和洗涤缓冲液-1 中含有的胍盐，若与漂白剂或酸混合，可能产生高反应性化合物。
   1. 结合缓冲液：将 300 mL 结合缓冲液浓缩液与 200 mL 100% 异丙醇混合，配制成 500 mL 工作浓度的结合缓冲液。室温保存。
      注意：结合缓冲液可促进循环核酸与硅胶膜的最佳结合。500 mL 结合缓冲液足以分别处理 1、2、3、4 或 5 mL 血浆样本各 276、138、92、69 或 55 个，并可在室温下稳定保存 1 年。
   2. 洗涤缓冲液-1：将 19 mL 洗涤缓冲液-1 浓缩液与 25 mL 96–100% 乙醇充分混合，配制成 44 mL 工作浓度的洗涤缓冲液-1。室温保存。
      注意：洗涤缓冲液-1 可去除结合在硅胶膜上的杂质。44 mL 工作浓度的洗涤缓冲液-1 足以处理约 73 个 1/2/3/4/5 mL....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Agilent 高灵敏度 DNA 试剂盒	Agilent Technologies, Inc.	5067-4626	高灵敏度 DNA 检测试剂常用于下一代测序文库的样本质量控制。
cf-DNA/cf-RNA 保存管	Norgen Biotek Corp.	63950	Norgen 的 cf-DNA/cf-RNA 保存管是封闭式真空塑料管，用于在储存和运输过程中采集并保存人全血样本中的游离 DNA（cfDNA）、循环肿瘤 DNA、游离 RNA（cf-RNA）以及循环肿瘤细胞。
QIAamp 循环核酸提取试剂盒	Qiagen	55114	QIAamp 循环核酸提取试剂盒可高效纯化来自人血浆、血清及其他无细胞体液中的循环核酸。
QIAvac 24 Plus 真空抽滤装置	Qiagen	19413	QIAvac 24 Plus 真空抽滤装置专为并行处理 QIAGEN 离心柱的真空操作而设计。
QIAvac 连接系统	Qiagen	19419	与 QIAvac 连接系统配合使用时，QIAvac 24 Plus 真空抽滤装置可用作流穿系统。含有潜在感染性物质的样本流穿液将被收集至独立的废液瓶中。
QIAvac 连接系统	Qiagen	19419	与 QIAvac 连接系统配合使用时，QIAvac 24 Plus 真空抽滤装置可用作流穿系统。含有潜在感染性物质的样本流穿液将被收集至独立的废液瓶中。
其他材料
50 mL 离心管
碎冰
乙醇（96–100%）
56 °C 的加热块或类似设备（可容纳 2 mL 收集管）
异丙醇（100%）
微量离心机
磷酸盐缓冲液（PBS）
移液器（可调式）
无菌移液器吸头（建议使用带气溶胶屏障的吸头，以防止交叉污染）
可容纳 50 mL 离心管且温度可达 60 °C 的水浴锅或加热块