循环游离DNA（cfDNA）的分离：一种基于二氧化硅膜的方法从癌症患者血浆中提取cfDNA 关键词：循环游离DNA，cfDNA，血浆，癌症，二氧化硅膜，提取

摘要

来源：Palande, V. 等. 癌症患者血浆样本中游离DNA的检测。J. Vis. Exp. (2020)

本视频介绍了一种基于二氧化硅膜的方法，用于从人血浆样本中分离循环游离DNA（cfDNA）。cfDNA是癌症诊断和评估的一种有前景的生物标志物。 

方案

所有涉及人类受试者的实验程序均按照机构、国家及国际有关人类福利的指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审核。

1. 从 1 mL 血浆中纯化循环游离 DNA

注意：此步骤使用商业试剂盒进行（参见材料表）。所有缓冲液均由试剂盒提供。

1. 缓冲液和试剂的准备
   注意：切勿将酸性溶液或漂白剂直接加入样本制备废液中。裂解缓冲液、结合缓冲液和洗涤缓冲液-1 中含有的胍盐，若与漂白剂或酸混合，可能产生高反应性化合物。
   1. 结合缓冲液：将 300 mL 结合缓冲液浓缩液与 200 mL 100% 异丙醇混合，配制成 500 mL 工作浓度的结合缓冲液。室温保存。
      注意：结合缓冲液可促进循环核酸与硅胶膜的最佳结合。500 mL 结合缓冲液足以分别处理 1、2、3、4 或 5 mL 血浆样本各 276、138、92、69 或 55 个，并可在室温下稳定保存 1 年。
   2. 洗涤缓冲液-1：将 19 mL 洗涤缓冲液-1 浓缩液与 25 mL 96–100% 乙醇充分混合，配制成 44 mL 工作浓度的洗涤缓冲液-1。室温保存。
      注意：洗涤缓冲液-1 可去除结合在硅胶膜上的杂质。44 mL 工作浓度的洗涤缓冲液-1 足以处理约 73 个 1/2/3/4/5 mL 血浆样本，并可在室温下稳定保存 1 年。
   3. 洗涤缓冲液-2：将 13 mL 洗涤缓冲液-2 浓缩液与 30 mL 96–100% 乙醇充分混合，配制成 43 mL 工作浓度的洗涤缓冲液-2。室温保存。
      注意：洗涤缓冲液-2 可去除结合在硅胶膜上的杂质。43 mL 工作浓度的洗涤缓冲液-2 足以处理约 56 个 1/2/3/4/5 mL 血浆样本，并可在室温下稳定保存 1 年。
   4. 向含有 310 μg 冻干载体 RNA 的离心管中加入 1,550 μL 洗脱缓冲液，配制成浓度为 0.2 μg/μL 的载体 RNA 溶液。充分溶解载体 RNA 后，将其分装为适当体积的分装液，于 -30 °C 至 -15 °C 保存。分装液冻融次数不得超过 3 次。按照表 1所示，将洗脱缓冲液中重悬的载体 RNA 加入裂解缓冲液中。
      注意：由于载体 RNA 无法直接溶解于裂解缓冲液中，需先在洗脱缓冲液中溶解，再加入裂解缓冲液。首先，当样本中目标分子含量极低时，载体 RNA 可增强核酸在硅胶膜上的结合效率；其次，大量载体 RNA 的存在可降低 RNA 降解的风险。
2. 开始提取前，将离心柱和样本恢复至室温，必要时用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）将样本体积调整至 1 mL。预热两个水浴锅或加热块，分别放置 50 mL 离心管和 2 mL 收集管，温度分别设定为 60 °C 和 56 °C。
3. 向一个 50 mL 离心管中加入 100 μL 蛋白酶 K、1 mL 血浆以及 0.8 mL 含有 1.0 μg 载体 RNA（按步骤 1.1.4配制）的裂解缓冲液。盖紧离心管盖，脉冲式涡旋振荡 30 秒，确保管内液体形成明显涡流。充分混匀对有效裂解至关重要。
   注意：涡旋振荡后应立即进入步骤 1.4，不得延迟。
4. 将溶液在 60 °C 下孵育 30 分钟。
5. 打开管盖，向管中加入 1.8 mL 结合缓冲液，盖上管盖后脉冲式涡旋振荡 15–30 秒，充分混匀。
6. 将所得混合液置于冰上孵育 5 分钟，然后将硅胶膜离心柱插入连接真空泵的真空装置中。随后，将一个 20 mL 管延长器牢固插入敞开的离心柱中，以防止样本泄漏。
7. 小心将孵育后的混合液倒入离心柱的管延长器中，开启真空泵。待所有裂解液完全通过离心柱后，关闭真空泵，将压力释放至 0 mbar，取下并弃去管延长器。
   注意：为避免交叉污染，应小心弃去管延长器，防止其内容物溅到相邻离心柱上。
8. 将离心柱从真空装置中取出，插入收集管中，在室温下以 11,000 x g 离心 30 秒，以去除残留的裂解液。弃去穿流液。
9. 向离心柱中加入 600 μL 洗涤缓冲液-1，在室温下以 11,000 x g 离心 1 分钟，弃去穿流液。
10. 向离心柱中加入 750 μL 洗涤缓冲液-2，在室温下以 11,000 x g 离心 1 分钟，弃去穿流液。
11. 向离心柱中加入 750 μL 乙醇（96–100%），在室温下以 11,000 x g 离心 1 分钟，弃去穿流液。
12. 将离心柱放入一个洁净的 2 mL 收集管中，以 20,000 x g 离心 3 分钟。
13. 将离心柱放入一个新的 2 mL 收集管中，打开管盖，在 56 °C 下孵育 10 分钟，彻底干燥膜组件。
14. 将离心柱放入一个洁净的 1.5 mL 洗脱管中。向离心柱膜中心加入 20–150 μL 洗脱缓冲液，盖上管盖，在室温下孵育 3 分钟。
    注意：确保洗脱缓冲液已平衡至室温。若使用少于 50 μL 的洗脱缓冲液，应小心将其加至膜中心，以确保结合的 DNA 完全洗脱。洗脱体积并非固定，可根据下游应用调整。回收的洗脱液最多可达 5 μL，且通常少于加入离心柱的洗脱体积。
15. 将回收的洗脱液在微量离心机中以 20,000 x g 离心 1 分钟，以完成核酸的洗脱，并于 -20 °C 保存。

样本编号	裂解缓冲液 (mL)	洗脱缓冲液中的载体RNA (μL)
1	0.9	5.6
2	1.8	11.3
3	2.6	16.9
4	3.5	22.5
5	4.4	28.1
6	5.3	33.8
7	6.2	39.4
8	7	45
9	7.9	50.6
10	8.8	56.3
11	9.7	61.9
12	10.6	67.5
13	11.4	73.1
14	12.3	78.8
15	13.2	84.4
16	14.1	90
17	15	95.6
18	15.8	101.3
19	16.7	106.9
20	17.6	112.5
21	18.5	118.1
22	19.4	123.8
23	20.2	129.4
24	21.1	135

表1. 处理1 mL血浆样本所需的裂解缓冲液和载体RNA（溶于洗脱缓冲液中）的体积。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Agilent 高灵敏度 DNA 试剂盒	Agilent Technologies, Inc.	5067-4626	高灵敏度 DNA 检测试剂常用于下一代测序文库的样本质量控制。
cf-DNA/cf-RNA 保存管	Norgen Biotek Corp.	63950	Norgen 的 cf-DNA/cf-RNA 保存管是封闭式真空塑料管，用于在储存和运输过程中采集并保存人全血样本中的游离 DNA（cfDNA）、循环肿瘤 DNA、游离 RNA（cf-RNA）以及循环肿瘤细胞。
QIAamp 循环核酸提取试剂盒	Qiagen	55114	QIAamp 循环核酸提取试剂盒可高效纯化来自人血浆、血清及其他无细胞体液中的循环核酸。
QIAvac 24 Plus 真空抽滤装置	Qiagen	19413	QIAvac 24 Plus 真空抽滤装置专为并行处理 QIAGEN 离心柱的真空操作而设计。
QIAvac 连接系统	Qiagen	19419	与 QIAvac 连接系统配合使用时，QIAvac 24 Plus 真空抽滤装置可用作流穿系统。含有潜在感染性物质的样本流穿液将被收集至独立的废液瓶中。
QIAvac 连接系统	Qiagen	19419	与 QIAvac 连接系统配合使用时，QIAvac 24 Plus 真空抽滤装置可用作流穿系统。含有潜在感染性物质的样本流穿液将被收集至独立的废液瓶中。
其他材料
50 mL 离心管
碎冰
乙醇（96–100%）
56 °C 的加热块或类似设备（可容纳 2 mL 收集管）
异丙醇（100%）
微量离心机
磷酸盐缓冲液（PBS）
移液器（可调式）
无菌移液器吸头（建议使用带气溶胶屏障的吸头，以防止交叉污染）
可容纳 50 mL 离心管且温度可达 60 °C 的水浴锅或加热块