基于自动毛细管电泳的游离DNA片段大小分布分析：一种基于DNA微芯片的方法，用于研究从生物液体中分离的DNA片段的大小分布

摘要

来源：Palande, V. 等. 癌症患者血浆样本中游离DNA的检测。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们采用自动化毛细管电泳技术分析游离DNA（cfDNA）片段的大小分布。该技术有助于深入了解癌细胞在凋亡过程中释放的DNA片段特征。

方案

1. 通过Fragment Analyzer检测cfDNA的DNA片段大小分布

1. 开始操作前的步骤：将DNA染料浓缩液和DNA凝胶基质在室温下平衡30分钟。
2. 制备凝胶-染料混合液
   注意：操作时需谨慎，因为DMSO已知可促进有机分子进入组织。
   1. 通过涡旋DNA染料浓缩液小瓶10秒，使其充分解冻。用移液器吸取15 µL该浓缩液加入DNA凝胶基质小瓶中，并于4 °C避光保存。
   2. 再次涡旋盖紧的小瓶10秒，直至肉眼观察到凝胶与染料充分混合。
   3. 将混合液倒入离心过滤装置的上部接收腔中。
   4. 在室温下以2,240 x g ± 20% 离心10分钟。
   5. 根据良好实验室规范，标记装有已制备凝胶-染料的试管并丢弃滤膜。标记试管并记录制备日期。
      注意：根据良好实验室规范丢弃滤液。该凝胶-染料混合液可用于5个高灵敏度（HS）DNA芯片。若未使用超过1小时，应于4 °C保存。避光条件下可保存长达6周。
3. 加载凝胶-染料混合液时，确保芯片预处理工作站底板的位置正确，并将卡扣调至最低位置。
   1. 将凝胶-染料混合液在室温下平衡30分钟，同时注意避免光照。
   2. 从密封袋中取出一个新的HS DNA芯片，放置于芯片预处理工作站上，然后吸取9.0 µL凝胶-染料混合液，将其加入芯片井底部标有“G”的位置。
      注意：吸取凝胶-染料混合液时，应避免吸入可能沉积在小瓶底部的颗粒。向HS DNA芯片井中加样时，应将移液器吸头完全插入，以防止产生大气泡。此外，移液器接触井口边缘会导致结果不佳。
   3. 将推杆置于1 mL位置，关闭芯片预处理工作站。确保锁扣发出“咔哒”声锁定，并将计时器设为60秒，然后按下推杆直至被卡扣固定；恰好60秒后，使用释放机构松开推杆。
   4. 当推杆回退至至少0.3 mL刻度时，等待5秒，然后缓慢将其拉回至1 mL位置。打开芯片预处理工作站，再次吸取9.0 µL凝胶-染料混合液，加入HS DNA芯片井底部标有“G”的位置。
4. 加载DNA标记物时，将5 µL DNA标记物加入标有梯形符号的井中。对所有11个样品井重复此操作。
5. 加载DNA分子量标记物和样品时，将1 µL DNA分子量标记物加入标有梯形符号的井中，然后在所有11个样品井中分别加入1 µL样品（已使用的井）或1 µL标记物（未使用的井）。
6. 将HS DNA芯片水平放入适配器中，在2,400 rpm条件下涡旋60秒。确保涡旋过程中固定HS DNA芯片的凸起部分不受损坏。
7. 将HS DNA芯片插入片段分析仪时，打开仪器盖，确认电极盒已正确插入，并且芯片选择器位于片段分析仪中的“dsHigh Sensitivity DNA” 位置。
8. 小心地将HS DNA芯片装入仅能单向插入的插槽中，然后关闭盖子，确保电极盒准确嵌入HS DNA芯片的各个孔中。
9. 片段分析仪软件屏幕上的显示会通过屏幕左上角的芯片图标指示已插入的HS DNA芯片和已关闭的盖子状态。
10. 启动HS DNA芯片运行时，从仪器屏幕上的“Assay” 菜单中选择dsDNA High Sensitivity Assay，然后正确填写样本名称表格，输入样本名称和备注等信息，并点击屏幕右上角的“Start” 按钮开始芯片运行。
11. HS DNA芯片运行后的电极清洗：实验一完成，立即取出已使用的HS DNA芯片，并根据良好实验室规范进行处理。执行以下步骤以确保电极清洁，无前次实验残留物。
    1. 缓慢将350 µL去离子分析级水加入电极清洗装置的一个井中，打开仪器盖后将电极清洗装置放入片段分析仪中，然后关闭盖子，等待约10秒。
    2. 打开盖子取出电极清洗装置，再等待10秒，使电极上的水分蒸发后，再关闭盖子。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2100 生物分析仪	安捷伦科技公司	G2939BA	2100 Bioanalyzer 系统是一种成熟的自动化电泳工具，用于生物分子样品的质量控制。
可调节夹具用于引物站	安捷伦科技公司	5042-1398	与注射器联用，用于芯片引物施加特定压力。
cf-DNA/cf-RNA 保存管	Norgen Biotek Corp.	63950	Norgen 的 cf-DNA/cf-RNA 保存管是封闭式真空塑料管，用于在储存和运输过程中采集并保存人全血样本中的游离 DNA（cf-DNA）、循环肿瘤 DNA（ctDNA）、游离 RNA（cf-RNA）以及循环肿瘤细胞
芯片预处理工作站	安捷伦科技公司	5065-4401	用于将凝胶基质加载到芯片中，每个检测试剂盒均配有注射器— 用于RNA、DNA和蛋白质检测。包含引物站、秒表和1个注射器夹
电极清洁试剂盒	安捷伦科技有限公司	5065-9951	防止交叉污染。去除电极上的细菌或蛋白质污染物。
凝胶基质滤光片	安捷伦科技公司	185-5990	用于DNA染料浓缩液与DNA凝胶基质的充分混匀
IKA Basic Chip 涡旋振荡器	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	用于在Bioanalyzer分析芯片上充分混匀DNA标记物与DNA样本
50 ml 离心管
乙醇（96–100%)
56℃加热块或类似设备 °C（可容纳2 ml收集管）
磷酸盐缓冲液（PBS）
移液器（可调式）
无菌移液器吸头（建议使用带气溶胶屏障的移液器吸头，以帮助防止交叉污染）
可容纳50 mL离心管并在60 °C下运行的水浴锅或加热块 °C