微滴数字聚合酶链式反应：一种生成纳米微滴PCR反应以检测稀有肿瘤突变的方法

摘要

来源：Bonner, E. R. 等. 患者生物流体中肿瘤相关循环DNA的检测与监测. J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们介绍了一种逐步生成乳化纳米液滴的实验方法，用于通过数字聚合酶链式反应（dPCR）检测目标核酸。

方案

1. 使用数字PCR检测和定量目标DNA

1. 准备用于8个PCR条形管孔的数字PCR（dPCR）反应体系，并额外增加10%体积：加入220 µL基因分型主混合液、每种10 µM野生型和突变型探针各8.8 µL、每种10 µM正向和反向引物各39.6 µL，以及17.6 µL液滴稳定油。
2. 通过移液器将整个反应体系上下吹打10–20次，轻柔混匀。在加入液滴稳定油后，切勿涡旋或离心反应体系。
3. 取一个8孔PCR条形管，将38 µL dPCR反应体系直接加入每个孔的底部。使用洁净的移液器吸头去除任何气泡。
   注意： 相互锁紧或紧密堆积的PCR条形管可能产生静电荷，导致在分析dPCR数据时出现液滴融合和噪声信号。为避免此问题，应将条形管分装至不同的生物危害袋中，避免袋子过度填充，并防止管子相互摩擦。
4. 向PCR条形管的相应孔中加入12 µL预扩增的DNA样本。对于阴性对照，加入12 µL MB H₂O。
   注意： 循环游离DNA（cfDNA）样本应在多个重复孔中进行分析。对于脑脊液（CSF）样本，至少进行双重复分析；对于血浆/血清样本，每个样本应进行三重复分析。
5. 将整个反应体系用移液器上下吹打10次，轻柔混匀反应体系与DNA样本。
6. 取一个新的液滴生成仪芯片，将PCR条形管中第1–8孔的全部液体转移至芯片中对应的A–H通道。避免移液器吸头接触通道底部。
7. 取一个新的洁净PCR条形管并插入液滴生成仪中。在仪器计算机的软件中扫描或手动输入液滴生成仪芯片ID。为每个8个通道输入名称。点击 开始运行 以开始样本的液滴化。
8. 液滴化完成后，取出PCR条形管并加盖封口盖。
9. 将条形管转移至热循环仪中，并用另一个每孔含有80 µL水的条形管进行平衡。
10. 设置热循环程序 如下：95 °C 预变性10分钟；45个循环的两步法扩增：95 °C 变性30秒，退火温度延伸2分钟；98 °C 延伸10分钟；最后在10 °C 保存。
    1. 将升降温速率设为0.5 °C/s，并将样本体积设为80 µL。
11. 热循环完成后，取出条形管并转移至定量仪。移除PCR条形管盖，更换为高速封口盖。
12. 打开定量仪及其连接的计算机和仪器软件。启动仪器软件，点击 设置运行。
13. 将条形管放入定量仪中。
14. 取一个新的定量仪芯片，在仪器中扫描或手动输入芯片ID，然后将芯片插入仪器。
15. 将金属屏蔽盖置于芯片上方，并关闭仪器盖。
16. 在计算机软件中，为本次dPCR运行及每个8个通道（A–H）输入名称。选择 快速模式 （必须与高速封口盖配合使用），然后点击 开始 以开始定量分析。
17. 定量完成后，取下金属屏蔽盖（保留以供重复使用），并妥善处理PCR条形管和芯片。在仪器计算机上，运行日志将包含每次运行的结果文件。使用每个样本的.fcs文件通过分析软件进行数据分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Raindance 消耗品试剂盒	Bio-Rad	20-04411	包含液滴生成仪芯片、定量仪芯片、PCR 八联管盖（含高速盖）以及液滴稳定油
Raindance Sense 仪器	Bio-Rad		定量分析仪器
Raindance Source 仪器	Bio-Rad		液滴生成仪器
RainDrop Analyst II 软件	RainDance Technologies		用于数据分析的 Analyst 软件
Thermomixer C	Eppendorf	14 285 562PM
MiniAmp 热循环仪	Thermofisher Scientific	A37834
PCR 八联管管盖	VWR	10011-786
PCR 八联管	Axygen	PCR-0208-C
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix	New England Biolabs Inc	M0494S