MSC接种支架制备：一种用于制备可植入小鼠模型的间充质干细胞接种支架的技术

摘要

来源：Sheets, K. T. 等. 胶质母细胞瘤的影像引导切除及治疗性干细胞接种支架的颅内植入. J. Vis. Exp. (2018)

本视频介绍了将间充质干细胞（MSCs）接种到可生物降解的聚乳酸（PLA）支架上的技术。制备好的支架可植入脑部手术切除腔内，细胞可能由此向肿瘤病灶迁移。此外，这些细胞可经基因工程改造以表达治疗性蛋白，从而诱导癌细胞发生凋亡。

方案

1. 细胞培养与支架制备

注意：支架应在小鼠植入前 48 小时准备好。以下体积均为单个支架的用量。根据需要增加支架数量时，相应按比例增加试剂用量。

1. 将聚乳酸（PLA）支架切割成与切除腔大小相近的片状（约 2 mm × 2 mm）。可使用剪刀手动切割，或使用打孔器以提高重复性。
2. 将支架浸入70%乙醇中15分钟进行灭菌，随后浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中。在准备细胞接种期间，将支架置于含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中。
3. 使用0.05%胰蛋白酶（T75培养瓶使用3–5 mL）消化贴壁的间充质干细胞（MSCs）。在37 °C孵育5分钟。确认细胞完全脱落之后，向培养瓶中加入7–10 mL DMEM以中和胰蛋白酶活性。
4. 将培养瓶中的细胞悬液转移至15 mL离心管中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。每份支架所需接种的细胞数为5 × 10⁵ 个MSCs，通过在100 × g条件下离心5分钟收集细胞沉淀。
5. 吸除上清液，并将每5 × 10⁵ 个细胞重悬于5 µL DMEM中。
6. 通过轻拍使支架干燥，为接种做准备。
   1. 用镊子将支架从DMEM中取出，暂时放置于6孔板的盖子上。再用镊子将支架提起，使多余的DMEM液滴留在盖子表面。
   2. 将支架再次放置于盖子上另一干燥洁净的位置。重复此操作3–5次，然后将部分干燥的支架转移至新的6孔板中用于接种。每份支架均需重复此步骤。
      注意：支架部分干燥时最有利于细胞接种。若支架过湿，细胞易从支架表面滑落并贴附于孔板底部；若支架过干，细胞悬液无法充分铺展至整个支架表面，导致初始细胞分布不均。
7. 使用移液器轻轻吹打干细胞冻存管，使细胞悬液混匀，以防部分细胞沉降至管底。
8. 缓慢吸取2.5 µL新鲜混匀的MSC悬液，直接滴加在支架表面，形成覆盖支架顶部的小液滴。
9. 向每个孔的边缘加入300 µL DMEM，以防止细胞液滴过快蒸发。在37 °C孵育30分钟，使细胞充分贴附于支架表面。
10. 用镊子轻轻将孔板中的支架翻转。再次接种2.5 µL新鲜混匀的MSC悬液（最终每份支架共接种5 × 10⁵ 个细胞）。在37 °C孵育30分钟，使细胞贴附于支架另一侧。
11. 向6孔板每孔加入2 mL DMEM完全覆盖支架。轻轻抬起支架，使培养基能够流至支架下方。在植入手术前，于37 °C继续孵育48小时。
12. 24小时后检查支架，若观察到培养基过度蒸发或因pH失衡导致颜色异常，应及时补充或更换培养基。