胶质瘤细胞的荧光标记：一种基于慢病毒载体转染的方法以获得表达荧光蛋白的胶质瘤细胞用于深层组织成像

摘要

来源：Benitez, J. A. 等. 活体成像胶质母细胞瘤异种移植模型的荧光分子断层成像技术. J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们介绍一种对胶质瘤细胞进行基因工程改造以表达红外荧光蛋白（iRFP）的实验方案。这些带有荧光标记的胶质瘤细胞可用于深层组织成像，以研究脑肿瘤的发生与发展过程。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 使用 FP635 或 FP720 构建体标记胶质母细胞瘤细胞

1. 根据以下方案制备并纯化慢病毒：
   1. 观察第1天接种的培养皿。当细胞融合度达到80–90%时，即可进行转染。
      ​注意：细胞应仍有空间进行1–2次细胞分裂
   2. 通过将四种质粒分装至一个50 mL离心管中来配制质粒混合物。对于12个15 cm培养皿的制备，使用270 µg转移载体、176 µg pMDL（Gag/Pol）、95 µg pVSVG（水疱性口炎病毒糖蛋白）和68 µg pREV。
   3. 配制13.5 mL的0.25 M CaCl₂（用过滤的ddH₂O稀释），加入质粒混合物中。再加入13.5 mL 2× BBS溶液。轻轻颠倒数次混匀，并在室温（22–26 °C）下孵育15分钟。
   4. 将转染混合物（以滴加方式均匀分布）加入每个培养皿中（每皿2.25 mL）。轻轻摇晃培养皿，然后在3% CO₂、37 °C条件下过夜孵育（16–20小时）。
   5. 观察细胞。细胞应接近完全融合。如果慢病毒载体质粒中含有可见标记（如GFP），可进行视觉评估转染效率。理想情况下，转染效率应>90%。
   6. 移除培养基，向每个培养皿中加入15 mL新鲜DMEM + 2% FBS，并转移至10% CO₂、37 °C条件下过夜孵育。
   7. 收集第一次上清液：收集并合并来自各培养皿的上清液（12个培养皿 × 15 mL/皿 = 180 mL）。
   8. 向每个培养皿中加入15 mL新鲜DMEM + 2% FBS。将培养皿在10% CO₂、37 °C条件下过夜孵育。盛有慢病毒上清液的容器应置于次级 containment 容器中（密封塑料袋即可），并在4 °C保存。
   9. 浓缩病毒制备物：通过超速离心浓缩病毒颗粒。在20 °C下以70,000 × g离心上清液2小时。推荐使用锥形管（而非圆底管）和摆动桶转子（而非固定角转子）（仅因该组合更易于定位几乎不可见的沉淀）。我们使用锥形管配合Beckman SW28转子（可容纳六根管）在20 °C下以19,400 r.p.m.离心2小时。每根管中加入30 mL上清液。12个15 cm培养皿制备所得上清液总体积为360 mL；因此，处理全部体积需连续进行两次离心。装入离心管，进行第一次离心，倒出上清液但不扰动沉淀，重新装入新鲜病毒上清液后进行第二次离心。
   10. 倒掉上清液，将倒置的离心管置于纸巾上使残留液体自然沥干。使用抽吸装置吸除残留液滴，以彻底去除沉淀中的液体。沉淀应仅表现为一个微小的半透明斑点，几乎不可见。
   11. 用100 µL 1× HBSS重悬病毒沉淀。避免产生泡沫。用100 µL 1× HBSS冲洗离心管内壁。合并两次冲洗液，最终体积为200 µL。
   12. 转移至带螺口盖的微量离心管中，用Parafilm封口，低速涡旋15–30分钟。重悬后的病毒制备物外观可从澄清至微乳白色不等。
   13. 在台式微量离心机上短暂离心10秒以澄清悬浮液。将上清液转移至新的带螺口盖微量离心管中。将上清液分装为20 µL每份。此病毒上清液为体外实验级质量。
2. 在15 cm培养皿中，使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养约2.0 × 10⁶ 个来自人脑胶质瘤细胞系的细胞；或在T75培养瓶中，使用DMEM/F12 1:1培养基（含B27添加剂以及人重组表皮生长因子（EGF；20 ng/mL）和FGF（10 ng/mL））培养2.0 × 10⁶ 个人源胶质母细胞瘤（GBM-PDX）球状体。
3. 将所有细胞维持在37 °C、5% CO₂及100%相对湿度条件下培养。
4. 解离细胞。
   1. 对于胶质瘤细胞：移除培养皿中的上清液，并向胶质瘤细胞中加入3–5 mL 1×胰蛋白酶。
   2. 对于GBM球状体：用移液器将细胞转移至15 mL离心管中。
      1. 在室温下使用台式离心机以200 × g离心5分钟，使GBM球状体沉淀。
      2. 移除上清液，加入3–5 mL细胞解离溶液。
   3. 将所有细胞在37 °C孵育10–15分钟。
5. 通过反复吹打数次小心解离细胞（确保球状体和胶质瘤细胞完全解离），然后以200 × g离心5分钟使细胞沉淀。
6. 移除上清液，用移液器反复吹打，以5 mL培养基重悬细胞。通过台盼蓝染色排除法测定细胞活力。
7. 用移液器将1.0 × 10⁶ 靶细胞接种至含5 mL培养基的10 cm培养皿中。
8. 以感染复数（MOI）为5的表达荧光蛋白的慢病毒感染细胞，并在37 °C孵育。
9. 24小时后，移除转导细胞的培养基，加入5 mL新鲜培养基，并在37 °C继续孵育48小时。
10. 如上所述，使用胰蛋白酶将感染后的细胞解离为单细胞悬液。以200 × g离心5分钟，沉淀细胞，并用500 µL分选溶液（含1% FBS的磷酸盐缓冲液（PBS））重悬。
11. 将细胞悬液移入FACS管中。加入1 µL/mL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）二盐酸盐共染色，以排除死细胞。设置流式细胞仪门控时需使用阴性对照（未转导细胞及未转导细胞/DAPI染色）。
12. 将荧光阳性/DAPI阴性的细胞分选至分选溶液中，并将分选后的细胞收集至15 mL锥形离心管中。
13. 以200 × g离心5分钟沉淀分选后的细胞，移除上清液，用5 mL培养基重悬。用移液器将细胞接种至10 cm培养皿中。在37 °C孵育至少48–72小时。
14. 如上所述解离分选后的细胞，并接种至多个培养皿中进行 体内 实验，以扩增细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/高糖	HyClone/GE	SH30022.1
DMEM/F12 1:1	Gibco	11320-082
FBS	HyClone/GE	SH30071.03
Accutase	创新细胞技术	AT-104
胰蛋白酶	HyClone/GE	SH30236.01
B27添加剂	Gibco	17504044
人重组 EGF	Stemcell Technologies	2633
人重组 FGF	Stemcell Technologies	2634
DPBS	康宁	21-031-00
FACS 管	Falcon	352235
DAPI	赛默飞世尔科技	62248
p24 酶联免疫吸附试验	Clontech	632200
细胞分选仪	索尼	SH8007
超速离心机 Optima L-80 XP	贝克曼库尔特	392049
组织培养 100 mm 培养皿	奥林巴斯塑料	25-202
组织培养 150 毫米培养皿	奥林巴斯塑料公司	25-203
T75 组织培养瓶	康宁	430720U
50 mL 一次性离心管	康宁	430290
质粒：慢病毒转移载体	Verma 实验室，索尔克生物研究所
慢病毒包装载体	pMDL、pRev 和 pVSVG	K4975-00
无内毒素大提纯	Endo-free Maxiprep Kit Qiagen	12632
1X— HBSS	Invitrogen	14025-092
15 cm 组织培养皿
0.45 µm 滤器单元，500 mL 容量
锥底超速离心管	贝克曼	358126
圆底超速离心管	贝克曼	326819
24孔组织培养板
荧光显微镜
多通道移液器
ELISA酶标仪