脑肿瘤干细胞（BTSC）迁移实验用于药物处理研究：一种体外活细胞成像技术，用于分析药物处理对BTSC迁移的影响

摘要

来源：Restall, I. 等. 活细胞成像实验用于研究胶质母细胞瘤脑肿瘤干细胞的迁移与侵袭 视频实验杂志 (2018)

在本视频中，我们通过趋化迁移实验板对脑肿瘤干细胞进行迁移实验，以分析目标药物对活体脑肿瘤干细胞迁移的影响。活细胞成像技术有助于在实验过程中对细胞迁移进行可视化观察和定量分析。

方案

1. 脑肿瘤干细胞迁移实验

1. 在T25培养瓶中接种200,000个细胞，加入8 mL完全培养基，于计划进行迁移实验前1–2周开始培养。
   注意： 接种后至进行实验的时间间隔将根据所用BTSC培养物的生长速率而有所不同。
   1. 为检测药物处理对迁移的影响，可通过将相应体积的溶剂（如DMSO）或药物储备液直接加入含细胞的培养基孔中，对细胞进行预处理。
2. 通过在表面包被一层薄胶原蛋白，制备趋化迁移板（图1A）。
   1. 计算96孔趋化迁移板中需要包被胶原蛋白的孔数。每种实验条件至少设置三个重复孔。
   2. 将5 mg/mL的I型胶原蛋白储备液用含0.14%乙酸的细胞培养级水稀释至0.2 mg/mL。
   3. 将0.2 mg/mL的胶原蛋白溶液分别加入膜插件孔和底部储液池孔中。
      注意： 底部储液池每孔需225 µL，膜插件孔每孔需75 µL，以实现适当的包被。
   4. 将迁移板置于37 °C培养箱中孵育1小时。吸除孔内胶原溶液时避免刮伤胶原涂层。
   5. 用无菌1×PBS洗涤孔两次。若板子不立即使用，吸除PBS后可在4 °C保存最多2周。使用前需将趋化迁移板恢复至室温。
3. 准备趋化迁移板的底部储液池。
   1. 向趋化迁移板的底部储液池孔中加入225 µL不含生长因子但补充10% FBS作为趋化因子的培养基。
   2. 以倾斜角度轻轻将膜插件放入底部储液池，避免产生气泡。
4. 将细胞接种至趋化迁移板的膜插件中。
   1. 将解离后的BTSCs重悬于不含生长因子的培养基中，细胞密度为50,000个细胞/mL。若需评估不同药物处理下的迁移能力，可在培养基中添加相应药物。或者，在接种时接种等量的预处理细胞与对照细胞，并维持最终药物浓度不变。
   2. 在目标处理条件下，将步骤1.4.1中的BTSCs悬液50 µL接种至迁移板的每个孔中。
5. 进行趋化迁移成像。
   1. 将趋化迁移板放入活细胞成像系统中，设置自动成像软件每1–2小时获取一次板的显微图像，持续最多72小时。使用商用软件（见材料表），右键点击时间轴，将扫描间隔设置为每2小时一次，持续24小时。
      注意： 不同BTSC培养物的成像时间间隔和总时长可能不同；建议初始设置为每2小时一次，持续72小时，待积累经验后再调整。若无自动成像系统，可使用连接成像软件的显微镜和相机手动获取相同视野的图像。
   2. 图像采集完成后，获取整个实验的图像数据，并使用分析软件创建处理定义，以区分细胞与膜背景及迁移孔（图1B，红色掩模）。使用商用软件（见材料表），选择新建处理定义，将BTSCs的处理参数设置为：种子阈值52，扩展阈值85，尺寸调整（像素）-1，最小面积200 μm²。将此处理定义应用于膜的底侧。若该分析无法准确区分细胞与膜背景，请进行相应调整。
   3. 收集每个实验条件三个重复孔膜底侧的细胞表面积数据，该数据仅统计已穿过孔的细胞。以迁移细胞的表面积（μm²）随时间变化作图（图1C）。
      注意： 确保在首个时间点，膜顶侧接种并计数的细胞相对数量在所有处理组间相近（各孔间差异小于20%），以避免接种不均带来的影响。使用商用软件（见材料表）进行数据采集时，可启动在步骤1.5.2中创建的处理定义，点击指标，再点击图表/导出，然后点击数据导出。

结果

图1： 活细胞成像观察BTSC迁移 （A） 这是一个96孔趋化迁移板的示例，在进行BTSCs迁移实验前，该板已包被一层薄薄的I型胶原蛋白。图像显示：i）组装完整的板（包含盖子、膜插件和储液槽）；ii）分离后的三个部分；iii）膜插件顶部的特写图像；iv）膜插件底部的特写图像；v）底部储液槽的特写图像。 （B） 这些是实验开始时（0 h）和24 h时BTSC迁移的代表性图像。图像聚焦于细胞最初接种...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Matrigel 基质	Corning	356230
96 孔板	Eppendorf	30730119
T25 Nunc EasYFlask	ThermoFisher	156367
Falcon 15 mL 圆锥管	ThermoFisher	352096
IncuCyte ClearView 96 孔趋化性检测板	Essen Bioscience	4582
IncuCyte Zoom 活细胞分析系统	Essen Bioscience	4545
IncuCyte Zoom 活细胞分析软件	Essen Bioscience	2016A Rev1
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma	D8537
细胞培养级水	Lonza BioWhittaker	17-724Q
胎牛血清（FBS）	Invitrogen	12483-020
大鼠 I 型胶原蛋白	Trevigen	3440-100-01
Accumax 细胞解离液	Innovative Cell Technologies	AM105