脑肿瘤干细胞（BTSC）神经球侵袭实验：一种用于分析药物处理对神经球来源BTSC侵袭影响的体外实验方法

摘要

来源：Restall, I. 等。用于研究胶质母细胞瘤脑肿瘤干细胞迁移与侵袭的活细胞成像实验。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了体外脑肿瘤干细胞（BTSC）侵袭实验，通过活细胞成像技术测定药物处理对神经球来源的BTSC侵袭能力的影响。

方案

1. 脑肿瘤干细胞神经球侵袭实验

1. 在T25培养瓶中接种200,000个细胞，加入8 mL完全培养基，于计划进行侵袭实验前1–2周开始培养。
   注意：从接种到进行实验的时间取决于所用BTSC细胞系的增殖速率。
   1. 对于预处理细胞，在神经球准备接种进行侵袭实验前，按预定时间将目标化合物以所需浓度加入培养瓶中。
2. 等待神经球平均大小达到约150–200 μm；通常需要7–14天，具体时间取决于所用BTSC细胞系。
   注意：培养瓶中神经球大小存在分布差异是常见现象。
3. 轻柔倾斜并用移液器混匀培养瓶，将每种处理条件下的500 μL BTSC神经球转移至1.5 mL离心管中，用于接种三个重复孔。
   注意：步骤1.3.1–1.3.2为可选步骤，但建议在新BTSC细胞系首次进行侵袭实验时执行。
   1. 为确定最终进入孔中的神经球密度，请按照步骤1.3准备一个1.5 mL离心管。轻轻混匀神经球后，取100 μL加入另一个96孔板中，静置5分钟，使神经球依靠重力沉降。
   2. 在显微镜下检查神经球数量，确保成像区域包含多个神经球，但不过度拥挤。
      注意：侵袭性神经球需要足够空间，使其直径可增至原来的三倍而不与邻近神经球相互接触。可通过计数每孔神经球数量，并在步骤1.3中调整从T25培养瓶加入1.5 mL离心管的神经球数量，来优化每孔接种量。
4. 将含有步骤1.3所得细胞的1.5 mL离心管置于冰上，并在冰上完成步骤1.5–1.7。
5. 让神经球在1.5 mL离心管底部依靠重力沉降5分钟，同时将标记好的96孔板预冷于冰上。
6. 将神经球重悬于细胞外基质蛋白中。
   1. 每种处理条件在冰上准备500 μL浓度为0.4 mg/mL的I型胶原溶液：加入459 μL培养基（不含生长因子）、40 μL 5 mg/mL胶原储备液和0.92 μL无菌1N NaOH（表1）。
      注意：每种处理条件需500 μL胶原溶液：其中300 μL用于三个重复孔（每孔100 μL），另留200 μL余量。若需药物处理，应在此处按目标终浓度加入，并从溶液的培养基组分中扣除相应体积。本方案以I型胶原作为细胞外基质蛋白，但其他任何细胞外基质蛋白均可测试。此外，对于侵袭速率较慢的BTSC细胞系，可在培养基中补充生长因子或FBS以提高侵袭速率。
   2. 待步骤1.5中的神经球沉降后，尽可能吸除上清液，避免损失底部的神经球沉淀。轻轻将神经球重悬于步骤1.6.1制备的500 μL胶原溶液中。
7. 将100 μL胶原与神经球混合液加入冰上的96孔板中三个重复孔内。在冰上静置5分钟，使神经球沉降。
8. 将96孔板转移至37 °C培养箱中孵育5分钟，以促进胶原聚合。
9. 立即准备对96孔板进行成像。
   1. 将96孔板放入活细胞成像系统的载物盘或显微镜载物台上，获取图像作为接种时神经球大小的参考，此时尚未开始侵袭。
   2. 每隔一小时获取一次图像，直至侵袭速率趋于平稳；通常在24小时内达到该状态。
      注意：成像间隔可根据所用设备进行调整。对于具有不同侵袭速率的BTSC细胞系，也可调整成像间隔和总持续时间。
10. 测定BTSC随时间侵袭基质过程中表面积的增加情况。
    注意：不同处理条件下，接种时各组细胞表面积（以三个重复孔的平均值计算）应相近（各孔间差异小于20%），以确保BTSC侵袭差异不受接种神经球数量或大小的影响。
    1. 使用活细胞分析系统进行图像采集时，采用10X物镜，对三个重复孔每孔采集四张图像。为测定代表孔内细胞汇合度百分比的相对细胞表面积，设置图像处理定义，特异性突出细胞区域，排除孔背景干扰。使用商业软件（见 材料表），选择新建处理定义，将分割调整值设为0.8，面积最小值设为300 μm²，偏心率最大值设为0.99。若该分析无法准确区分细胞与背景，请进行相应调整。
       注意：若采用其他方法对神经球侵袭过程进行时序成像，建议在多个视野下对三个重复孔进行长期观察。然而，若每次成像未对准完全相同的视野，将增加所收集数据的标准误差。可使用计算机软件辅助测量每张图像中侵袭细胞的表面积。
    2. 收集每个时间点各孔的总细胞表面积数据（相对或绝对值），计算三个重复孔的平均值。通过绘制细胞面积随时间增加的曲线图来展示BTSC的侵袭过程。

胶原溶液制备
胶原储存液浓度（mg/mL）	5
终浓度胶原（mg/mL）	0.4
所需孔数：	5
总体积（μL）	500
胶原储存液体积（μL）	40
1N NaOH 体积（μL）	0.92
培养基体积（μL）	459

表1：0.4 mg/mL I型胶原蛋白溶液的配制。 表中列出了已知的起始浓度和所需的终浓度。所列体积足以将神经球接种至三个重复孔，另加两孔余量，可包含一个处理条件，具体操作详见实验方案步骤1。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
大鼠 I 型胶原蛋白	Trevigen	3440-100-01
氢氧化钠	VWR	BDH3247-1
乙酸	Millipore Sigma	AX0073-6
96 孔板	Eppendorf	30730119
T25 Nunc EasYFlask	ThermoFisher	156367
Falcon 15 mL 圆底离心管	ThermoFisher	352096
Incucyte ClearView 96-孔趋化板	Essen Bioscience	4582
IncuCyte Zoom 活细胞实时分析系统	Essen Bioscience	4545
IncuCyte Zoom 活细胞实时分析软件	Essen Bioscience	2016A Rev1
青霉素-链霉素	Sigma	P4333
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma	D8537
胎牛血清（FBS）	Invitrogen	12483-020