在图案化神经元上共培养胶质母细胞瘤细胞：一种体外监测胶质母细胞瘤细胞在大鼠海马神经元上迁移的技术

摘要

来源：Guyon, J. 等 在图案化神经元上共培养胶质母细胞瘤干细胞样细胞以研究迁移和细胞相互作用。J. Vis. Exp. (2021)

本视频介绍了一种在微图案化神经元上共培养胶质母细胞瘤细胞的实验方法，该方法可模拟胶质母细胞瘤干细胞样细胞在肿瘤周围区域沿神经元迁移时对髓鞘化神经纤维束的侵袭过程。该实验有助于分析药理学药物对胶质瘤中胶质母细胞瘤细胞沿神经元迁移的抑制作用。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 图案化载玻片的制备

1. 微图案化基底的制备
   1. 将18 mm圆形玻璃盖玻片进行空气/等离子体活化处理5分钟。将盖玻片置于密闭容器中，并在干燥器内加入100 μL的(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，处理1小时。
   2. 在10 mM碳酸盐缓冲液（pH > 8）中，加入100 mg/mL的聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯（分子量5,000，Peg-SVA），孵育1小时。用超纯水充分冲洗，并在化学通风橱中干燥。
      注意： 此步骤完成后，样品可在避光条件下于4°C保存，以备后续使用。
   3. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中加入光引发剂4-苯甲酰基苯甲酰三甲基氯化铵（PLPP），终浓度为14.7 mg/mL。
      注意： 也可使用浓缩形式的PLPP，即PLPP凝胶，其可缩短紫外（UV）照射降解PEG刷所需时间（100 mJ/mm²）。
2. 光引发剂凝胶的涂布
   1. 将3 μL PLPP凝胶与50 μL无水乙醇混合，滴加于载玻片中心。将样品置于化学通风橱中，直至无水乙醇完全挥发。
      注意： 此步骤完成后，样品可在避光条件下于4°C保存，以备后续使用。
3. 玻璃载玻片的微图案化
   1. 将盖玻片安装至Ludin腔室中，并放置于配备自动对焦系统的显微镜的电动载物台上。
   2. 将预期微图案对应的图像载入软件，设置以下参数：重复4×4次，间距200 μm，紫外照射剂量1,000 mJ/mm²。自动紫外照射程序完成后，用多次PBS洗涤去除PLPP。
      注意： 若使用了PLPP凝胶，则需用去离子水充分洗涤去除，随后用N₂气流吹干，并于4°C保存。
   3. 加入层粘连蛋白（laminin，50 μg/mL溶于PBS）孵育30分钟，随后用PBS充分洗涤。
      ​注意： 可将纯化的绿色荧光蛋白（GFP，10 μg/mL溶于PBS）的荧光溶液与laminin混合，以便通过荧光显微镜观察微图案。

2. 神经元与胶质母细胞瘤细胞共培养的准备

1. 培养 胚胎大鼠海马神经元
   1. 解剖胚胎期（E18）大鼠的海马体，并将组织转移至含有 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）/1 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）/青霉素-链霉素的 15 mL 离心管中。去除多余液体时避免使海马体干燥。
   2. 加入5 mL含青霉素（10,000 units/mL）/链霉素（10,000 μg/mL）和1 mM HEPES的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），于37 °C孵育15分钟。用HBSS/HEPES/青霉素-链霉素溶液洗涤2次，每次2–3分钟，并使组织在此溶液中保留2–3分钟。
   3. 使用两支火焰抛光的巴斯德移液管对组织进行解离，每支移液管上下吹打10次，注意尽量减少泡沫产生。计数细胞并评估细胞悬液的活力。按以下说明将神经元接种于微图案化盖玻片上。
      注意： 提取后细胞存活率为85–90%。
2. 细胞培养用于 微图案化盖玻片上的神经元
   1. 用 PBS 重悬微图案化玻片，并加入完全神经元细胞培养基孵育。
   2. 将取自E18 Sprague-Dawley大鼠的海马神经元直接接种于微图形化玻璃盖玻片上，接种密度为每平方厘米50,000个细胞² 在含3%马血清的Neurobasal培养基（NBM）中培养。将微图案化神经元置于培养箱中（37 °C，5% CO₂）₂48 小时。
      注意： 约6小时后，可观察到原代海马神经元附着于层粘连蛋白微图案上。
3. 共培养 人胶质母细胞瘤干细胞样细胞与神经元共培养
   1. 当球形细胞在悬浮培养中生长时，以200 × g离心5分钟 g用5 mL PBS洗涤类球体，并将细胞与0.5 mL细胞解离试剂共同孵育（参见 材料表在37 °C下孵育5分钟。
   2. 加入4.5 mL完全NBM培养基（按前述方法添加B27补充剂、肝素、成纤维细胞生长因子2、青霉素和链霉素），并采用自动计数技术对细胞进行计数。
   3. 在含有3%马血清的NBM培养基中，将1,000个GBM细胞接种于微图形化神经元培养体系上。将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。₂，以及95%的湿度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷	Sigma	440140-100ML	氨基可用于mPEG-SVA的生物偶联
96孔圆底板	Sarstedt	2582624	用于制备球状体
Accutase	Gibco	A11105-01	长期储存于-20 °C，短期储存于4°C，为球状体解离酶
B27	Gibco	12587	储存于-20 °C，使用前需解冻
碱性成纤维细胞生长因子	Peprotech	100-18B	储存于-20 °C，使用前需解冻
Countess细胞计数板	Invitrogen	C10283	用于细胞计数
盖玻片	Marienfeld	111580	细胞培养基底
干燥器滤芯	Sigma	Z363456-6EA	用于在(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷处理过程中减少水分
DPBS 10倍浓缩液	Pan Biotech	P04-53-500	储存于4 °C
75 cm² 培养瓶	Falcon	10497302
HBSS	Sigma	H8264-500ML
肝素钠	Sigma	H3149-100KU	储存于4 °C
层粘连蛋白		114956-81-9	促进神经元黏附
75 cm² 培养瓶	Falcon	10497302
肝素钠	Sigma	H3149-100KU	储存于4 °C
Leonardo软件			用于加载设计的微图案
MetaMorph软件	Molecular Devices LLC	NA	显微镜自动化软件
甲基纤维素	Sigma	M0512	用NBM稀释至终浓度为2%
Neurobasal培养基	Gibco	21103-049	储存于4 °C
Nikon TiE（S Fluor，20x/0.75 NA）			配备电动载物台的倒置显微镜
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	储存于4 °C
PLPP	Alveole		用于降解PEG刷层的光引发剂
聚乙二醇-琥珀酰亚胺基戊酸酯（mPEG-SVA）	Laysan Bio	VA-PEG-VA-5000-5g	用作抗污染涂层
胰蛋白酶-EDTA	Sigma	T4049-100ML	用于解离贴壁细胞