从牛脑毛细血管中分离和培养原代脑周细胞：一种无内皮细胞污染的周细胞分离与培养方案 关键词：周细胞，原代培养，脑毛细血管，内皮细胞污染，牛脑，细胞分离

摘要

来源：Hørlyck, S. 等 用于胞质钙离子测量和钙成像研究的脑毛细血管周细胞培养。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们演示了从牛脑毛细血管中分离和培养周细胞且不含有内皮细胞污染的实验步骤。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 牛毛细血管的接种与培养

1. 第0天：将0.7 mL胶原蛋白IV储备液与6.3 mL PBS混合。将该溶液加入T75培养瓶中，在室温（RT）下放置2小时，或在4 °C过夜。
2. 从培养瓶中移除胶原蛋白溶液，并用PBS洗涤三次。
3. 加入7 mL纤连蛋白工作液，在室温下放置30分钟。随后移除纤连蛋白溶液，并立即接种毛细血管片段。
4. 在等待30分钟期间，将一管毛细血管片段在37 °C水浴中解冻。
5. 毛细血管解冻后，立即转移至含有30 mL DMEM-完全培养基（DMEM-comp）的离心管中，在500 × g、室温下离心5分钟。移除DMEM-comp，将毛细血管沉淀重悬于10 mL新鲜DMEM-comp中。
6. 将10 mL细胞悬液转移至包被好的T75培养瓶中，在37 °C、10% CO₂的培养箱中培养4–6小时，使毛细血管贴壁。
   注意：与常规的5% CO₂相比，细胞在10% CO₂条件下的生长速率更高。
7. 培养4–6小时后，在光学显微镜下观察培养瓶。此时部分毛细血管应已贴附于培养瓶底部（图1，第0天）。
8. 配制生长培养基（GM），小心吸除毛细血管上的DMEM-comp培养基，并更换为10 mL新配制的GM。
9. 第2天：移除毛细血管上的GM，更换为10 mL新配制的GM。此时在光学显微镜下应可见毛细血管周围有细胞向外生长（图1，第2–3天）。

2. 从牛脑毛细血管中分离原代周细胞

1. 第4天：在光学显微镜下观察毛细血管细胞。
   注意：此时培养瓶的细胞融合度应约为60–70%，以提供适量的周细胞（图1，第4天）。若未达到此状态，则弃去原培养基，加入10 mL新鲜培养基，继续将培养瓶置于培养箱中培养一天。
2. 吸除培养基，并用PBS轻柔洗涤细胞。
3. 加入2 mL解冻的内皮细胞用胰蛋白酶-EDTA溶液，将培养瓶放入培养箱中消化1–3分钟。在此期间应频繁取出培养瓶并在显微镜下观察。
   注意：内皮细胞应变圆并从瓶壁脱落；周细胞则呈现“鬼影”样形态，仍附着于培养瓶表面。此步骤较为关键且具挑战性。必须尽可能去除大部分内皮细胞，以避免污染周细胞单层培养物，但消化时间过长也可能导致周细胞脱落。每次消化所需时间可能略有差异，因此在处理过程中必须频繁在显微镜下观察培养瓶。
4. 当内皮细胞开始变圆时，轻敲培养瓶，使已松动的内皮细胞脱落。
5. 为终止胰蛋白酶消化，向培养瓶中加入10 mL DMEM完全培养基。用培养基轻柔冲洗培养瓶数次，以去除脱落的内皮细胞。随后吸除含有内皮细胞的悬浮液。这些内皮细胞可用于其他实验目的。
6. 向培养瓶中加入10 mL DMEM完全培养基。在光学显微镜下观察，确认周细胞仍附着于瓶底且存活。将培养瓶重新放回培养箱中，使富集周细胞的培养物继续生长。
   注意：在接下来的几天内密切观察培养状态非常重要。若仍有较多内皮细胞生长，可再次进行胰蛋白酶处理。
7. 继续培养周细胞单层培养物，每隔一天更换一次DMEM完全培养基。在光学显微镜下观察细胞生长情况（图1，第5–8天）。

结果

图1：毛细血管的培养及周细胞的分离。 毛细血管从新鲜的牛脑中分离，并于第0天接种至培养瓶中。通过光学显微镜连续观察牛脑毛细血管的外延生长及后续的周细胞分离过程。第4a天显示胰蛋白酶处理前内皮细胞的生长情况，第4b天显示处理后立即观察到的残留结构。第8a天的焦平面用于观察任何毛细血管残留物，而第8b天的焦平面则聚焦于可见周细胞生长的层面。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS	Sigma Aldrich	D8537	磷酸盐缓冲液
IV型胶原蛋白	Sigma Aldrich	C5533
T-75 培养瓶	Sigma Aldrich	CLS3972
胎牛血清（FBS）  	PAA/GE Healthcare	A15-101
纤连蛋白	Sigma Aldrich	F1141
胰蛋白酶-EDTA	Sigma Aldrich	T4299
光学显微镜	Olympus	Olympus CK2	带相差功能的直立光学显微镜
DMSO	Sigma Aldrich	471267
肝素	Sigma Aldrich	H3149
细胞培养箱	Thermo Fisher
离心机	Thermo Fisher	Heraeus Multifuge 3SR+	用于沉淀细胞的标准大容量离心机
杜氏改良伊格尔培养基	Sigma Aldrich	D0819
青霉素G钠/硫酸链霉素 	Sigma Aldrich	P0781
MEM非必需氨基酸 	Sigma Aldrich 	M7145