从人脑中分离脑毛细血管:从人脑组织中提取脑毛细血管的优化方法

摘要

来源:Hartz， A. M. S. et al.从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管。J. Vis. Exp.（2018 年）

该视频展示了从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管的过程。然后可以使用分离的毛细血管生成离体血脑屏障模型。

方案

所有涉及人类参与者的程序均已按照机构、国家和国际人类福利指南执行，并已由当地机构审查委员会审查。

1. 脑部样品制备

>注意:图 1A 显示了下面描述的整个隔离过程的工作流程图。人脑组织可以源自皮层的任何部分，可以新鲜或冷冻使用。冷冻的脑组织可以在室温下解冻（无缓冲液;10 g 为 ~30 分钟）。为了获得可比较的结果，每次实验应从同一大脑区域获得脑组织。该协议针对未冷冻的新鲜（死后间隔或 PMI <4 小时）人类大脑皮层进行了优化。

1. 人体脑组织的制备:记录脑组织的重量。以下方案中的所有数字均适用于 10 g 新鲜人脑组织。将脑组织放入 100 mm 培养皿中。用镊子小心地去除所有脑膜。用手术刀切掉白质。
2. 将人脑组织切碎:小心地切开脑组织，然后用手术刀将其切碎。切碎约 5 分钟（2-3 毫米块）。将脑组织转移到 Potter-Elvehjem 组织研磨机中。加入 30 mL 分离缓冲液。
   注意:切碎的组织块很难看到，因为脑组织在切碎过程中会变成糊状。

2. 均质化

1. Potter-Elvehjem 组织研磨机（间隙:150–230 μm）:以 50 rpm 的均质器速度，用 100 次冲程对每个样品进行均质化。记录每 25 笔画的时间和 100 笔画所需的总时间。有关建议的均质化方案，请参见表 1;均质化 10 g 人额叶皮层的总时间约为 22 分钟。请勿在空气中搅拌，以防止气泡。
2. Dounce 匀浆器（间隙:80–130 μm）:将匀浆转移到冰上的 Dounce 匀浆器中。用 20 次冲程（~6 秒/冲程，总共 ~2 分钟）使悬浮液均质化。避免气泡。

3. 离心

1. 将脑匀浆均匀分配到四个 50 mL 离心管中，并记录匀浆的总体积。将 50 mL 密度梯度缓冲液分配到离心管中（每管 12.5 mL）。使用 10 mL 分离缓冲液冲洗研杵和均质器，并分配到四个离心管中（每管 ~2.5 mL）。
2. 用盖子盖紧离心管。通过剧烈摇动试管混合匀浆、密度梯度培养基和缓冲液。在 4 °C 下以 5,800 x g 离心 15 分钟（固定角转子）;选择中等减速速度以保持颗粒附着在管上。弃去上清液，将每个沉淀重悬于 2 mL 的 1% BSA 中。

4. 过滤

注意:要将毛细血管与红细胞和其他细胞碎片分离，需要几个过滤步骤。

1. 300 μm 网孔:重悬沉淀后，通过 300 μm 网过滤悬浮液。毛细血管通过网片过滤，而较大的血管和较大的脑碎片保留在网片上。用最多 50 mL 的 1% BSA 小心清洗网片。丢弃网格。
   注意:该过滤步骤可清除毛细血管悬浮液中任何较大的血管或脑碎片块。
2. 30 μM 细胞菌株过滤器
   注意:该过滤步骤将毛细血管与红细胞和其他脑碎片分离。
   1. 将步骤 4.1 中的毛细管滤液分布在五个 30 μm 细胞菌株过滤器上（每个细胞菌株过滤器约 10 mL 的毛细管滤液）。毛细血管被该过滤器阻挡，而红细胞、其他单细胞和小脑碎片通过过滤器并收集在滤液中。
   2. 用 25 mL 的 1% BSA 清洗每个过滤器。然后，将所有滤液倒在第六个过滤器上以提高产量。用 50 mL 的 1% BSA 清洗每个过滤器;保持细胞应变过滤器包含毛细管并丢弃滤液。

5. 毛细管采集

1. 将过滤器倒置，每个过滤器用 50 mL 的 1% BSA 将毛细管清洗到 50 mL 试管中。用 5 mL 移液器的移液管尖端轻轻施加压力，然后将其移过过滤器以洗掉脑毛细血管。
2. 确保洗掉所有脑毛细血管，尤其是过滤器边缘的毛细血管。避免气泡，因为这会使过滤过程更加困难，并增加毛细管损失的机会。

6. 洗涤

1. 收集毛细管后，将所有样品在 4 °C 下以 1,500 x g 离心 3 分钟（摆动桶转子）。去除上清液，将沉淀重悬于约 3 mL 的分离缓冲液中。将来自一个样品的所有重悬沉淀混合在 15 mL 锥形管中，并用分离缓冲液填充。在 4 °C 下再次以 1,500 x g 离心 3 分钟，然后再洗涤两次。
2. 用显微镜（100 倍放大倍率）和相机记录毛细管纯度（图 1B）。
   注意:10 克人脑组织的脑毛细血管产量通常约为 100 毫克。分离的脑毛细血管现在可用于实验、加工（例如裂解物、膜分离），或快速冷冻并在 -80 °C 下储存在冻存管中至少 6-12 个月（避免多次冻融循环）。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 中风 时间 1-25 7–7.5 26-50 岁 5–5.5 51–75 5–5.5 76–100 5–5.5 总时间: 22–24 分钟

表 1:均质方案。Potter-Elvehjem 组织研磨机的均质化方案，以 50 rpm 的均质化速度均质化 10 g 人类额叶皮层。请注意，前几次冲程需要额外的时间来匀浆碎的组织。在此初始均质化之后，每个行程的持续时间为 12 秒（向下运动为 6 秒，向上运动为 6 秒）。因此，在初始均质化后，可以在 1 分钟内完成 5 次冲程，或在 5 分钟内完成 25 次冲程。

结果

图 1:毛细管分离流程图。（A） 象形图说明了从新鲜人体组织中分离脑毛细血管的程序的主要步骤。 （B） 图为分离后在光学显微镜下分离的人脑毛细血管（100 倍放大）。

材料