来源：Hartz, A. M. S. 等. 从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管。J. Vis. Exp. (2018)
本视频展示了从新鲜的人脑组织中分离脑毛细血管的方法。分离得到的毛细血管可用于构建离体血脑屏障模型。
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方法文章
从人脑组织中分离脑毛细血管：一种优化的人脑毛细血管提取方法
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。
1. 脑组织样本制备
注意：图1A展示了下文所述整个分离流程的工作流程图。人脑组织可来源于大脑皮层的任何区域，可使用新鲜或冷冻的组织。冷冻脑组织可在室温下解冻（无需缓冲液；约30分钟解冻10 g）。为获得可比的结果，每次实验所用脑组织应取自相同的脑区。本方案针对未经冷冻的新鲜人脑大脑皮层（死后间隔时间或PMI <4 h）进行了优化。
- 人脑组织的准备：记录脑组织的重量。以下方案中的所有数值均适用于10 g新鲜人脑组织。将脑组织置于100 mm的培养皿中。用镊子小心去除所有脑膜。使用解剖刀切除白质。
- 人脑组织的切碎：用解剖刀小心地将脑组织切碎，持续约5分钟（切成2–3 mm大小的碎片）。将切碎的脑组织转移至Potter-Elvehjem组织研磨器中，加入30 mL分离缓冲液。
注意：由于脑组织在切碎过程中会变成糊状，因此切碎后的组织碎片难以观察。
2. 匀浆化
- 使用 Potter-Elvehjem 组织研磨器（间隙：150–230 µm）：以每分钟 50 转的速度，对每个样品进行 100 次研磨。每研磨 25 次记录一次时间，并记录完成 100 次研磨所需的总时间。参见表 1中的建议匀浆方案；匀浆 10 克人额叶皮层组织的总时间约为 22 分钟。切勿在空气中搅拌，以防止产生气泡。
- 使用 Dounce 匀浆器（间隙：80–130 µm）：将匀浆液转移至冰上的 Dounce 匀浆器中。用 20 次研磨处理悬浮液（每次约 6 秒，总计约 2 分钟）。避免产生气泡。
3. 离心
- 将脑匀浆液等量分装至四个50 mL离心管中，并记录匀浆液的总体积。将密度梯度缓冲液各50 mL分装入离心管中（每管12.5 mL）。用10 mL分离缓冲液冲洗研杵和匀浆器，并将冲洗液分装至四个离心管中（每管约2.5 mL）。
- 拧紧离心管盖。剧烈振荡离心管，使匀浆液、密度梯度介质和缓冲液充分混合。在4 °C条件下，以5,800 × g离心15分钟（固定角转子）；选择中等减速速度，以确保沉淀物附着在管壁上。弃去上清液，并将每管的沉淀物重悬于2 mL 1% BSA溶液中。
4. 过滤
注意：为了将毛细血管与红细胞及其他细胞碎片分离，需要进行多个过滤步骤。
- 300 µm 网筛：重悬沉淀后，将悬液通过 300 µm 网筛过滤。毛细血管可穿过网筛，而较大的血管和较大的脑组织碎片则留在网筛上。用最多 50 mL 的 1% BSA 小心冲洗网筛。弃去网筛。
注意：此过滤步骤可去除毛细血管悬液中的任何较大血管或脑组织碎片块。 - 30 µm 细胞筛过滤
注意：此过滤步骤将毛细血管与红细胞及其他脑组织碎片分离。- 将 步骤 4.1 得到的毛细血管滤液分装至五个 30 µm 细胞筛中（每个细胞筛约加 10 mL 毛细血管滤液）。毛细血管被截留在该筛上，而红细胞、其他单个细胞以及较小的脑组织碎片则穿过筛孔进入滤液中。
- 每个筛子用 25 mL 的 1% BSA 冲洗。随后，将所有滤液合并后倒入第六个筛子中以提高回收率。每个筛子再用 50 mL 的 1% BSA 冲洗；保留含有毛细血管的细胞筛，弃去滤液。
5. 毛细管采集
- 将滤膜倒置，用50 mL 1% BSA溶液冲洗每张滤膜上的毛细血管，冲洗液收集至50 mL离心管中。使用5 mL移液器的枪头轻轻施加压力，并在滤膜表面移动，以冲洗下脑毛细血管。
- 确保彻底冲洗所有脑毛细血管，特别是滤膜边缘部分。避免产生气泡，因为气泡会增加过滤难度，并提高毛细血管丢失的风险。
6. 清洗
- 收集毛细血管后，在 4 °C 条件下以 1,500 x g 离心所有样品 3 分钟（摆桶转子）。弃去上清液，并将沉淀重悬于约 3 mL 分离缓冲液中。将同一份样品的所有重悬沉淀合并至一个 15 mL 锥形管中，并用分离缓冲液充满。再次在 4 °C 条件下以 1,500 x g 离心 3 分钟，并重复洗涤两次。
- 使用显微镜（100 倍放大）和相机记录毛细血管纯度（图 1B）。
注意： 从 10 g 人脑组织中获得的脑毛细血管产量通常约为 100 mg。分离得到的脑毛细血管可用于后续实验，可进一步处理（例如，制备裂解液、膜组分分离），或进行速冻后置于 -80 °C 冻存管中保存至少 6–12 个月（避免反复冻融）。
| 冲程 | 时间 |
| 1–25 | 7–7.5 |
| 26–50 | 5–5.5 |
| 51–75 | 5–5.5 |
| 76–100 | 5–5.5 |
| 总时间： | 22–24 min |
表1：匀浆方案。 使用Potter-Elvehjem组织研磨器匀浆10 g人额叶皮层的匀浆方案，匀浆速度为50 rpm。注意，前几次研磨需要额外时间以充分匀浆切碎的组织。初始匀浆完成后，每次研磨持续12秒（向下运动6秒，向上运动6秒）。因此，初始匀浆后，每分钟可完成5次研磨，或5分钟内完成25次研磨。
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结果
图1： 毛细血管分离流程图。（A） 图示说明了从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管的主要操作步骤。（B） 图片显示了分离后直接在光学显微镜下观察的人脑毛细血管（100倍放大）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <strong>个人防护装备（PPE）</strong> | |||
| Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium | VWR, Radnor, PA, USA | 32916-636 | PPE |
| 一次性防护实验服 | VWR, Radnor, PA, USA | 470146-214 | PPE；由于使用人源组织材料，建议使用一次性实验服 |
| 一次性面罩 | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 19460102 | PPE；由于使用人源组织材料，建议使用一次性面罩 |
| <strong>安全材料</strong> | |||
| Clavies 高温高压灭菌袋 8 x 12 | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 01-815-6 | |
| Versi Dry 实验台纸 18" x 20" | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 14-206-32 | 用于覆盖工作区域 |
| VWR 锐器收集容器系统 | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 75800-272 | 用于废弃手术刀片 |
| 8.2% 漂白剂 Clorox Germicidal 64 oz. | UK Supply Center, Lexington, KY, USA | 323775 | |
| <strong>设备</strong> | |||
| 4 °C 冰箱 | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 13-986-148 | |
| Accume BASIC AB15 pH 计 | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | AB15 | |
| Heidolph RZR 2102 Control | Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA | 501-21024-01-3 | |
| Sorvall LEGEND XTR 离心机 | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 75004521 | |
| Leica L2 解剖显微镜 | Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA | 用于去除软脑膜 | |
| POLYTRON PT2500 匀浆器 | Kinematica AG, Luzern, Switzerland | 9158168 | |
| Scale P-403 | Denver Instrument, Bohemia, NY, USA | 191392 | |
| Standard mini 搅拌器 | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 1151050 | |
| Thermo-Flasks 液氮杜瓦瓶 | Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA | 11-670-4C | 用于组织冷冻 |
| Voyager Pro 分析天平 | OHAUS, Parsippany, NJ, USA | VP214CN | |
| ZEISS Axiovert 显微镜 | Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA | 用于检查分离的毛细血管 | |
| <strong>工具与玻璃器皿</strong> | |||
| Finnpipette II 移液器 1-5 mL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21377823T1 | 将毛细血管从滤膜上冲洗下来 |
| Finnpipette II 移液器 100-1,000 µL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21377821T1 | 用 BSA 重悬沉淀 |
| Pipet Boy | Integra, Hudson, NH, USA | 739658 | |
| 50 mL Falcon 管 25/架 - 500/箱 | VWR, Radnor, PA, USA | 21008-951 | |
| EISCO 手术刀片 | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | S95938C | 用于切碎脑组织 |
| PARAFILM | VWR, Radnor, PA, USA | 52858-000 | 用于覆盖烧杯和容量瓶 |
| Thermo Scientific Finntip 移液器吸头 5 mL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21-377-304 | 用于将毛细血管从滤膜上冲洗下来 |
| 60 mL 带鲁尔锁接头的注射器 | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | BD309653 | 与连接环配合使用以过滤毛细血管 |
| 手术刀柄 #4 | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10060-13 | 用于切碎组织 |
| Dumont 镊子 #5 | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11251-10 | 用于去除软脑膜 |
| Potter-Elvehjem 组织研磨器 | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | 3.43E+28 | 50 mL 体积，间隙：150-230 μm |
| Dounce 匀浆器 | VWR, Radnor PA USA | 62400-642 | 15 mL 体积，间隙：80-130 μm |
| Spectra/Mesh 编织滤膜（300 µm） | Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA | 146424 | 用于过滤毛细血管悬液，以去除可能残留的软脑膜 |
| pluriStrainers（孔径：30 µm） | pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany | 43-50030-03 | |
| 连接环 | pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany | 41-50000-03 | 可重复使用多次 |
| 1 L 容量瓶 | 用于配制分离缓冲液 | ||
| 1 L 烧杯 | 用于配制 1% BSA | ||
| 搅拌子 | 用于配制 1% BSA 和 Ficoll® | ||
| Schott 瓶（60 mL） | 用于配制 Ficoll® | ||
| 冰桶 | 保持所有物品低温 | ||
| 100 mm 培养皿 | 用于切碎脑组织 | ||
| 组织培养细胞刮刀 | VWR, Radnor, PA, USA | 89260-222 | 离心后用于去除上清液 |
| <strong>化学试剂</strong> | |||
| BSA 第五组分, A-9647 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647-500g | 使用含 Ca2+ & Mg2+ 的 DPBS 配制，需提前一天完成。配制过程中避免产生气泡。储存于冰箱中。使用前缓慢搅拌 10 分钟。 |
| DPBS 含 Ca<sup>2+</sup> & Mg<sup>2+</sup> | Hyclone | SH30264.FS | DPBS — 分离缓冲液的组成部分 |
| Ficoll PM400 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F4375 | 此处需精确称量。在带搅拌子的瓶中称重。加入 DPBS 后剧烈震荡。置于冰箱中过夜。次日早晨溶液将变得澄清。使用前轻轻搅拌 10-15 分钟。使用前保持在冰上。 |
| 葡萄糖（D-(+)葡萄糖） | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G7528 | 葡萄糖（D-(+)葡萄糖）浓度：5 mM |
| 氢氧化钠标准溶液 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 71474 | 用于调节 DPBS 的 pH 值 |
| 丙酮酸钠 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2256 | 浓度：1 mM |
