荧光肽类底物酶谱法：一种利用荧光底物在酶谱凝胶中检测蛋白酶活性的改良技术

摘要

来源：Deshmukh, A. A. 等. 利用荧光肽酶谱法检测蛋白酶活性. J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们采用酶谱法（zymography）这一电泳技术，分析生物样品中的蛋白水解活性。

方案

1. 肽酶谱凝胶中生物样本的电泳

1. 将样品溶解于常规明胶酶谱法样品缓冲液中（62.5 mM Tris-HCl，pH 6.8，25% 甘油，4% SDS，0.01% 溴酚蓝）。对于细胞和组织样品，建议每孔上样约 30 µg 总蛋白，MMP 标准品每孔上样 50–100 ng 蛋白。
2. 向电泳装置中加入 400 mL 1× Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液。每孔最多上样 35 µL 样品。 在 4 °C 条件下以 120 V 电压电泳 1.5 小时，或直至分子量标准指示目标蛋白酶已迁移至肽分离胶层（呈可见橙色）为止。
   注意：大多数基质金属蛋白酶（MMP）及其变体的分子量范围在 35–100 kDa 之间。当分子量标准显示该范围内的蛋白已进入肽分离胶层时，即可停止电泳。此原则同样适用于其他已知分子量的蛋白酶类别。若需检测更宽分子量范围内的多种蛋白酶，可减小分离胶层厚度，并增加肽分离胶层厚度。
3. 电泳结束后，从塑料夹板中取出凝胶，并在室温下用复性缓冲液（含 2.5% Triton X-100、1 µM ZnCl₂ 和 5 mM CaCl₂ 的 50 mM Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5）轻轻振荡洗涤三次，每次 10 分钟。 
4. 将凝胶转移至显色缓冲液（含 1% Triton X-100、1 µM ZnCl₂ 和 5 mM CaCl₂ 的 50 mM Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5）中，室温孵育 15 分钟。更换新鲜显色缓冲液后，在 37 °C 轻柔振荡条件下孵育 24 小时，确保凝胶完全浸没于溶液中。
5. 孵育 24 小时后，使用配备适当激发和发射滤光片的荧光凝胶成像系统对凝胶进行成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mm 空胶板	ThermoFisher Scientific	NC2015
20% SDS 溶液	Ambion	AM9820
3x 显影样品缓冲液	Bio-Rad	1610764
Azido-PEG3-Maleimide 试剂盒	Click Chemistry Tools	AZ107
PowerPac Basic 电源供应器	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein 双色蛋白标准品	Bio-Rad	161-0374
PrecisionGlide 皮下注射针头	Fisher Scientific	14-826