基于聚焦超声的微泡介导血脑屏障开放：一种通过声孔效应在小鼠血脑屏障中创建局部瞬时开放的技术

摘要

来源：Haumann, R. 等. 一种用于啮齿类动物血脑屏障开放的高通量图像引导立体定向神经导航与聚焦超声系统. J. Vis. Exp. (2020)

本视频介绍了一种通过微泡介导的聚焦超声（FUS）产生短暂开放来暂时性破坏血脑屏障（BBB）的方法。这些短暂的局部血脑屏障开放最终可用于将较大分子量的药物直接递送至脑实质。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 聚焦超声系统

注意：所述装置是基于市售组件自主研发的血脑屏障（BBB）破坏系统，包含一个3D打印的定制锥形部件和可拆卸的立体定位平台。该系统采用模块化设计，可根据现有设备和特定用途进行调整。本方案描述了对小鼠脑桥区域较大区域进行声穿孔的操作流程。通过调整靶向位置，可针对大脑的不同区域。本研究中使用了一个中心频率为1 MHz的单元素换能器，焦距为75 mm，孔径为60 mm，焦点区域为1.5 × 1.5 × 5 mm（峰值压力的半高全宽，FWHM）。换能器的焦平面通过动物颅骨，在与耳杆相交的水平面内定位。

1. 为啮齿类动物选择合适的用于血脑屏障开放的换能器。
   注意：根据微泡的特性和所使用的频率，声学参数（特别是机械指数 MI）可能需要相应调整。
2. 将换能器安装到3D打印的锥形装置中。
3. 在锥形装置的底端使用声学透明的聚酯薄膜（Mylar膜），以实现声束传播路径的声学耦合，并将锥形容器内注满脱气水。
4. 如图1所示，将换能器安装在动物上方的电动线性平台上，以实现换能器的自动垂直定位。
5. 根据研究需求设计可拆卸的立体定位平台，该平台应包括温度可控的加热装置、门齿固定杆和耳杆、麻醉系统以及多模态定位标记物，如图1和图2所示。立体定位平台的安装包含一个二维线性平台系统，可在声束下方对动物进行精确的自动定位（< 0.1 mm）。
6. 将换能器连接至如图1所示的声发射链路，该链路由换能器、函数发生器和功率放大器组成。
7. 建立图像处理流程，用于检测多模态定位标记物，从而实现对目标脑区的精确定位声孔化，并采集针式水听器检测到的空化信号数据。
8. 校准系统，并确定换能器焦点位置与动物在立体定位平台上垂直位置之间的对应关系。

2. 动物准备

注意：以下实验方案是针对小鼠设定的，但也可适用于大鼠。本实验使用雌性裸鼠 Foxn1-/-（6–8 周龄）。

1. 将动物置于动物房内至少适应一周，并定期称重。
2. 在聚焦超声（FUS）处理前30分钟，通过皮下（s.c.）注射给予布托啡诺（0.05 mg/kg），以启动镇痛治疗。
3. 使用3%异氟烷和2 L/min的O₂对动物进行麻醉，并确认动物已进入深度麻醉状态。在整个操作过程中维持麻醉，并监测呼吸频率和心率，根据需要调整异氟烷浓度。
4. 涂抹眼药膏以防止眼睛干涩，避免可能的眼部损伤。
5. 使用剃刀和脱毛膏去除头部顶部的毛发，随后用水清洗以去除残留物，防止皮肤刺激。
6. 对于使用生物发光成像（BLI）肿瘤模型的实验，使用29G胰岛素注射器经腹腔（i.p.）注射150 µL D-荧光素（30 mg/mL），用于BLI图像引导。
7. 插入26–30G尾静脉导管，并用少量肝素溶液（5 UI/mL）冲洗导管和静脉。用肝素溶液充满导管以防止血液凝固。
   注意： 当观察到血液反流进入导管时，表明导管插入良好。避免导管内出现气泡，以防发生栓塞。为避免注射压力过高，应确保导管长度尽可能短。
8. 将动物置于温度可控的立体定位平台上，以防止低体温。
   注意： 低体温会减少血液循环，可能影响微泡的注射/循环以及药物的药代动力学。
9. 使用耳杆和咬合杆将动物头部固定在立体定位平台上，用绑带固定身体，并用胶带将尾巴固定在平台上。

3. 体内图像引导聚焦超声

注意：本方案采用1 MHz单元素换能器，使用持续时间为10 ms的脉冲串脉冲，机械指数（MI）为0.4，脉冲重复频率为1.6 Hz，共40个周期，持续240秒。该方案针对以六氟化硫（SF₆）作为惰性气体、由磷脂稳定的微泡进行优化，微泡平均直径为2.5 μm，且超过90%的微泡直径小于8 μm。

1. 将装有动物的立体定位平台置于成像设备中（例如, 生物发光成像（BLI）或 X 射线成像，并对动物进行图像采集。
2. 结合多模态配准标记物与图像处理流程，根据换能器的焦点位置标记动物的位置。
3. 通过将脑部轮廓图覆盖在获取的X射线图像上，或利用BLI图像确定肿瘤中心，以确定目标区域（图2）。在Paxinos脑图谱中，使用颅骨标记点bregma和lambda作为参考点来确定大脑特定部位的位置。例如，脑桥位于相对于lambda的x=-1.0、y=-0.8和z=-4.5处。
4. 用胶带遮住动物的鼻孔和口腔，以防止超声耦合剂影响呼吸。
5. 在动物头部涂抹超声耦合剂。
6. 回缩动物颈部的皮肤，用超声耦合剂润滑针式水听器，并将针式水听器置于枕骨附近。
7. 使用图像处理流程和焦点来引导探头到达正确位置。
8. 将预设参数应用于所有连接的设备，并定位目标脑区。
   注意： 根据研究问题的不同，可对肿瘤或脑区进行单焦点或体积形状的声孔效应处理，如图所示 图2.
9. 按照制造商说明激活微泡。注射一剂120 µL（5.4 µg）的微泡。
10. 用生理盐水冲洗尾静脉导管，以检查导管是否通畅。
11. 注射微泡并开始超声辐照。
12. 使用针式水听器记录微泡空化现象。
13. 在声穿孔后给予血管内对比剂或药物。剂量、给药时机和方案取决于研究目的及所用药物。
    注意： 伊文思蓝是一种常用的染料，用于评估血脑屏障的开放情况。
14. 在预定时间点或达到人道终点前持续监测动物。

结果

图 1：聚焦超声设备设置。（A）聚焦超声设备的示意图。（B）聚焦超声设备的实物图。该系统由一个安装在1D线性位移台上的换能器组成，该位移台又置于一个2D位移台上，以实现自动3D定位。换能器安装在一个充满水的声束锥形腔内，底部由声学透明的聚酯薄膜（mylar膜）密封，将声波传导至动物颅骨。换能器连接至功率放大器，后者再连接至任意波形发生器（AWG），用于信号生成。为检测空化效应，使用一个可拆卸的水听器，并配合低噪声电压放大器。水听器放置于枕骨附近。该外部水听器的活性表面直径为2 mm，并通过超声耦合凝胶实现声学耦合。激发脉冲的高压信号和记录的空化信号均由标准的200 MHz示波器数字化，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 鲁尔锁型注射器	Becton Dickinson	309628	Plastipak
19 号针头	Terumo Agani	8AN1938R1
23 G 针头	Terumo Agani	8AN2316R1
3M Transpore 外科胶带	科学应用于生命	7000032707	或类似情况
任意波形发生器	Siglent		SDG1025，25 mHz，125 MSa/s
自动立体定位	自制		立体定位仪的所有部件均为自制
布鲁克In-Vivo Xtreme	Bruker		包含软件
缓冲氯化钠溶液	B. Braun Melsungen AG	220/12257974/110
盐酸丁丙诺啡	Indivior UK limitd		0.324 mg
笼具环境丰富化：纸浆智能屋	生物服务
碳滤器	Bickford	NC0111395	Omnicon f/air
陶瓷勺
棉签
D-荧光素钾盐	Gold Biotechnology	LUCK-1
乙醇	VUmc 药房		70%
伊文思蓝	Sigma Aldrich	E2129
Fresenius NaCl 0.9%	Fresenius Kabi		0.9% NaCl，1000 mL
Histoacryl	Braun Surgical		Histoacryl 0.5 mL
水听器	精密声学
胰岛素注射器	Becton Dickinson	324825/324826	0.5 mL 和 0.3 mL
异氟烷	TEVA Pharmachemie BV	8711218013196	250 mL
氯胺酮	Alfasan		10 %，10 mL
小鼠饲料：Teklad 全球 18% 蛋白质啮齿类动物饲料	Envigo	2918-11416M
Neoflon 导管	Becton Dickinson	391349	26 号针头，0.6 mm × 19 mm
示波器	Keysight Technologies		Infiniivision DSOX024A
塑料管	Greiner bio-one	210261	50 mL
功率放大器	电子学 & Innovation Ltd	210L	Model 210L
前置放大器直流耦合器	精密声学		序列号：DCPS94
剪刀	Sigma Aldrich	S3146-1EA	或类似情况
赛拉嗪	AST Farma		2%
SonoVue 微泡	Bracco		8 µl/mL
无菌水	Fresenius Kabi		1000 mL
注射器			可使用多种注射器
丁丙诺啡	Indivior UK有限公司		0.3 mg/mL
换能器	精密声学		1 MHz
镊子	Sigma Aldrich	F4142-1EA	或类似情况
超声耦合剂	Parker Laboratories 公司	01-02	Aquasonic 100
Vidisic 凝胶	博士伦		10 g