基于聚焦超声的微泡介导的血脑屏障开口:一种通过超声在小鼠血脑屏障中创建局部瞬时开口的技术

所有涉及人类参与者的程序均已按照机构、国家和国际人类福利准则执行，并已由当地机构审查委员会审查。

1. 聚焦超声系统

注意:所描述的设置是一个基于市售组件的内部构建的 BBB 干扰系统，包括一个 3D 打印的定制锥体和可拆卸的立体定向平台。该系统采用模块化设计，便于根据可用设备和特定用途进行修改。该协议描述了在小鼠大脑桥区较大区域进行超声的程序。通过调整目标位置，可以针对大脑的不同部分。在本研究中，使用了焦距为 75 mm、孔径为 60 mm、焦面积为 1.5 x 1.5 x 5 mm（峰值压力的 FWHM）的 1 MHz 单晶探头。换能器的焦平面通过动物的颅骨定位在与耳杆相交的水平面上。

1. 为啮齿动物的 BBB 开口选择合适的传感器。
   注意:根据微气泡的特性和采用的频率，声学设置，特别是机械指数 （MI），可能会发生变化。
2. 将换能器放入 3D 打印的锥体中。
3. 在锥体的底端采用透声聚酯薄膜，以实现光束传播路径的声耦合，并用脱气水填充锥体。
4. 如图 1 所示，将传感器安装在动物上方的电动线性载物台上，允许传感器自动垂直定位。
5. 根据研究要求设计一个可拆卸的立体定向平台，其中包括温控加热、咬合和耳杆、麻醉和多模态基准标记，如图 1 和图 2 所示。立体定向平台的安装包括一个 2D 线性平台系统，该系统允许在光束下精确自动定位 （< 0.1 mm） 动物。
6. 将换能器连接到图 1 所示的声发射链，该链由换能器、函数发生器和功率放大器组成。
7. 设计一个图像处理管道来检测多模态基准标记，这些标记允许对感兴趣的大脑区域进行精确的超声定位，并收集针式水听器检测到的空化数据。
8. 校准系统并确定传感器的焦点，使其与动物在立体定向平台上的垂直定位相对应。

2. 动物准备

注意:以下方案是为小鼠指定的，但可以适用于大鼠。在这些实验中，使用了雌性无胸腺裸鼠 Foxn1-/-小鼠 （6-8 周龄）。

1. 让动物在动物设施中适应至少一周，并定期为动物称重。
在
2. FUS 治疗前 30 分钟通过皮下 （sc） 注射丁丙诺啡 （0.05 mg/kg） 开始镇痛治疗。
3. 用 3% 异氟醚、2 L/min O₂ 麻醉动物，并验证动物是否已深度麻醉。在整个过程中保持动物麻醉，并监测呼吸频率和心率，以根据需要调整异氟醚的浓度。
4. 涂抹眼药膏以防止眼睛干涩并避免可能的伤害。
5. 用剃须刀和脱毛膏去除头顶的毛发，然后用水清洗以去除任何残留物，以免刺激皮肤。
6. 对于 BLI 肿瘤模型的实验，用 29G 胰岛素注射器腹膜内 （ip） 注射 150 μL D-荧光素 （30 mg/mL） 用于 BLI 图像引导。
7. 插入 26–30G 尾静脉导管，并用少量肝素溶液 （5 UI/mL） 冲洗导管和静脉。用肝素溶液填充导管，以避免血液凝固><。 注意:当血液回流到导管中时，可以看到良好的导管插入术。避免导管中出现气泡，以防止栓子。为避免注射压力过大，请确保导管的长度尽可能短。
8. 将动物放在温度调节的立体定向平台上，以避免体温过低><。 注意:体温过低会减少血液循环，这会影响微泡的注射/循环和药物的药代动力学。
9. 使用耳杆和咬杆将动物的头部固定并固定在立体定向平台上。用带子固定身体，并将动物的尾巴粘在平台上。

3. 体内图像引导聚焦超声

注意:对于该协议，使用了 1 MHz 单晶传感器，其音调脉冲持续时间为 10 ms，MI 为 0.4，脉冲重复频率为 1.6 Hz，40 个周期，持续 240 秒。该方案针对由含有六氟化硫 （SF₆） 作为无害气体的磷脂稳定的微泡进行了优化，其中平均气泡直径为 2.5 μm，超过 90% 的气泡小于 8 μm。

1. 将带有已安装动物的立体定向平台置于成像模式（例如，BLI 或 X 射线）中，并拍摄动物的图像。
2. 将多模态基准标记与图像处理管道结合使用，根据换能器的焦点标记动物的位置。
3. 通过在获取的 X 射线图像上放置大脑轮廓或使用 BLI 图像确定肿瘤中心来确定目标区域（图 2）。大脑特定部分的位置在 Paxinos 脑图谱中使用颅骨标记前囟和 lambda 作为参考点来指定。例如，pons 位于 lambda 的 x=-1.0、y=-0.8 和 z=-4.5 处。
4. 用胶带保护动物的鼻孔和嘴巴，以防止超声凝胶干扰呼吸。
5. 将超声凝胶涂抹在动物的头顶上。
6. 缩回动物颈部的皮肤，用超声凝胶润滑针头水听器，并将针头水听器直接放在枕骨附近。
7. 使用图像处理管道和焦点将传感器引导到正确的位置。
8. 将预配置的设置应用于所有连接的设备，并针对感兴趣的大脑区域。
   注意:根据研究问题，肿瘤或大脑区域可以作为单个焦点或体积形状进行超声处理，如图 2 所示。
9. 按照制造商的说明激活微气泡。注射一团 120 μL （5.4 μg） 微泡。
10. 用生理盐水冲洗尾静脉导管，以检查导管的开口。
11. 注入微气泡并开始音效。
12. 用针式水听器记录微气泡空化。
13. 超声后给予血管内造影剂或药物。剂量、时间和计划取决于研究目的和药物。
    注意:伊文思蓝是评估 BBB 开放的常见色素剂。
14. 监测动物直到预定的时间点或人道终点之前。

图 1:聚焦超声设置。（A） 聚焦超声装置的示意图。（B） 聚焦超声装置的图片。该系统由一个位于一维线性平台上的自上而下的传感器组成，位于第二个用于自动 3D 定位的二维平台上。换能器内置在一个充满水的光束锥中，底部用透声聚酯薄膜封闭，将声音传导到动物的颅骨。传感器连接到功率放大器，而功率放大器又连接到任意波形发生器 （AWG） 以产生信号。对于气蚀检测，使用可拆卸的水听器与低噪声电压放大器相结合。水听器放置在枕骨的直接附近。外部水听器具有 2 mm 的有源表面，并与超声凝胶进行声耦合。激励脉冲的高压信号和记录的空化信号都由标准 200 MHz 示波器数字化，并中继到控制计算机（未显示）进行动态处理和实时控制。

图 2:聚焦超声工作流程。聚焦超声系统的建议工作流程从 （A） 动物在可拆卸立体定向平台上的初始定位开始，注意声耦合凝胶的应用（在 BLI/X 射线后应用）。可以同时进行多模态成像以进行定位。（B） 起初，X 射线成像是一种可能性，而可以借助大脑轮廓来瞄准感兴趣的区域（这反过来又参考了小鼠脑图谱40，适应了颅骨的大小和姿势）。（C） 或者，可以将覆盖在 X 射线最大强度投影上的荧光素酶转染弥漫性中线胶质瘤肿瘤的 BLI 图像用于靶向。（D） 随后，将立体定向平台安装在动物处于治疗位置，并连接水听器和换能器。换能器自动驱动到治疗位置，并在推注注射后对选定的轨迹进行超声处理。该系统针对高通量实验进行了优化，其中多个平台允许交错工作，如上图所示。