基于子宫内电穿孔的基因递送技术：向小鼠胚胎小脑细胞注射质粒DNA的方法

摘要

来源：Feng W. 等。 利用子宫内电穿孔介导的基因转移技术进行小脑颗粒细胞中CRISPR介导的基因功能缺失分析。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了利用子宫内电穿孔技术将质粒DNA递送至小鼠胚胎小脑神经元细胞的方法。该技术有助于理解基因在正常脑发育过程中的体内功能，以及神经元细胞在肿瘤进展过程中基因表达的变化。

方案

1. 进行 In Utero 电穿孔

1. 繁殖6至8周龄的小鼠并准备相关工具 在子宫内 电穿孔。将雄性纯合子杂交 Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP 将小鼠与雌性CD-1小鼠交配。以检测到阴道栓的当天记为CD-1小鼠妊娠的第0.5天（E0.5）。在妊娠第13.5天（E13.5）对胚胎进行电穿孔。
   1. 使用拉针仪拉制硼硅酸盐玻璃毛细管（内径：0.6–0.8 mm）。拉制参数设置如下：P = 500，Heat = 560，Pull = 150，Vel = 75，Time = 250。用黑色墨水标记毛细管尖端，以便在注射过程中更清晰地观察。在体视显微镜下，使用直尺和尖头镊子修剪毛细管锥形部分，将尖端修剪至约6 mm长度。
   2. 保持毛细管的完整性，以确保实验的可重复性。修整时应制成单面斜面边缘，尖端应尽可能锋利，以便于穿透子宫壁并避免对胚胎组织造成损伤。
      注意： 或者，可使用微型研磨器将毛细管调整为35°角。毛细管可在无病原条件下，室温保存于10 cm培养皿中。
   3. 对手术器械进行高压灭菌。
   4. 将sgRNA质粒与pT2K-IRES-Luc以等体积混合，使每种质粒的终浓度至少为1 µg/µL，并用快绿染料对质粒溶液进行染色（终浓度为0.05%）。使用无内毒素的去离子水配制1%快绿储存液，并通过0.22 µm滤器过滤，以去除溶液中的染料颗粒。
      注意： 共转染 pT2K IRES-Luc 为可选步骤，但可在出生后通过生物发光成像识别成功电穿孔且存活的动物。根据拟进行手术的怀孕小鼠总数，准备足量的质粒混合物。每只小鼠使用约 15–20 µL 混合液（约对应 12 个胚胎）。立即开始手术操作。
2. 准备小鼠进行手术
   1. 用异氟烷麻醉怀孕的CD-1小鼠。在诱导箱中使用3–4 vol-%异氟烷（氧气流速：1.5 L/min）诱导麻醉，并通过鼻罩在手术期间以2 vol-%异氟烷维持麻醉。
      注意： 整个手术不应超过30分钟。如有必要，减少注射和电穿孔的胚胎数量。 手术时使用无菌手套。
   2. 将小鼠仰卧于加热垫上，并调整麻醉状态。
   3. 注射镇痛剂（安乃近，800 mg/kg 体重，皮下注射（s.c.），24 小时缓释）。
      注意： 可使用其他经批准的镇痛药替代安乃近。
   4. 手术期间涂抹眼药膏以防止眼睛干涩。
   5. 用胶带固定四肢，并用消毒剂对腹部进行消毒。用纱布覆盖小鼠，仅暴露手术区域。在手术区域及纱布上涂抹70%乙醇。
   6. 做一个长约2 cm的皮肤切口，用直手术剪刀轻轻扩大切口。找到白线，使用钝头组织剪刀在腹膜上做一个稍小的第二切口。
   7. 用预热的无菌1×PBS润湿打开的腹腔。
   8. 使用环形镊子小心地从腹腔中取出子宫角。仅在两个相邻胚胎的卵黄囊间隙处夹住子宫壁，轻柔牵拉。牵拉过程中避免对胚胎施加任何压力。必要时可扩大切口，并格外注意将子宫角放置于腹部时不要压迫子宫动脉的血流。
      注意： 在某些情况下，建议一次取出一个子宫角，在处理第二个子宫角之前将其复位。
3. 质粒DNA的注射与电穿孔
   1. 用制备好的玻璃毛细管吸取约15 µL有色质粒溶液。此过程中应避免产生气泡。
      注意： 质粒溶液浓度过高时容易堵塞针尖。注射前可先释放少量DNA以测试毛细管是否通畅。
   2. 用环形镊子轻轻夹住胚胎，找到颈部区域。
      注意： 如果胚胎位置不易注射，可跳过该胚胎，选择下一个。频繁调整胚胎位置可能会增加对胚胎造成损伤的风险。
   3. 用预先制备好的玻璃毛细管尖端，缓慢刺入小脑背侧，穿透后脑，进入第四脑室，随后注入约1 µL质粒混合物。确认染色的DNA未从脑组织泄漏，并可见呈菱形结构的染色区域。
      注意： 可选地，使用2.5倍放大镜以更清晰地观察第四脑室及周围血管。注射后应立即施加电脉冲，以防止质粒溶液扩散至其他脑室。
   4. 施加电方波脉冲（5次脉冲，32 mV，开启50 ms，关闭950 ms），使用镊子状铂金镊子（参见 材料表将电极置于两侧，负极覆盖耳部，正极置于子宫壁上方的小脑原基处。使用直径为5 mm的电极板，以实现对E13.5胚胎的有效电穿孔。
      注意： 通过操作少于三分之二的仔鼠以提高其存活率^rd 每只母鼠的胚胎总数。避免选择过于靠近宫颈的胚胎，否则操作可能导致分娩时出现并发症，并危及整窝幼仔。若电极过于靠近胚胎心脏，可能引起心脏骤停。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高压灭菌带	Kisker Biotech	150262
电穿孔仪（方波）	BTX	ECM830
内毒素去除大提试剂盒	Qiagen	12362
乙醇	Merck	107017
眼膏（Bepanthen）	Bayer	81552983
快绿染料	Merck	104022
滤器（0.22 µm）	Merck	F8148
直头镊子	精细科学工具公司	91150-20
纱布（X100 ES垫片 8f 10 × 10 cm）	Fisher Scientific	15387311
带纤维丝的玻璃毛细管	Narishige	GD1-2
加热垫	ThermoLux	463265 / -67
异氟烷	Zoetis	TU061219
环形镊	精细科学工具公司	11103-09
体视显微镜	Nikon	C-PS
手术剪	精细科学工具公司	91460-11
钝头手术剪	精细科学工具公司	14072-10
带5 mm盘状铂电极的镊子	Xceltis  GmbH	CUY650P5
安乃近	WDT
非无菌丝线缝合线（0.12 mm）	精细科学工具公司	18020-50
PBS（1×）	Life Technologies	14190169
钝头组织剪（11.5 cm）	精细科学工具公司	14072-10
pCAG-EGxxFP	Addgene	50716
pX330 质粒	Addgene	42230