基于子宫内电穿孔的基因递送技术：向小鼠胚胎小脑细胞注射质粒DNA的方法

摘要

来源：Feng W. 等。 利用子宫内电穿孔介导的基因转移技术进行小脑颗粒细胞中CRISPR介导的基因功能缺失分析。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了利用子宫内电穿孔技术将质粒DNA递送至小鼠胚胎小脑神经元细胞的方法。该技术有助于理解基因在正常脑发育过程中的体内功能，以及神经元细胞在肿瘤进展过程中基因表达的变化。

方案

1. 进行 In Utero 电穿孔

1. 繁殖6至8周龄的小鼠并准备相关工具 在子宫内 电穿孔。将雄性纯合子杂交 Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP 将小鼠与雌性CD-1小鼠交配。以检测到阴道栓的当天记为CD-1小鼠妊娠的第0.5天（E0.5）。在妊娠第13.5天（E13.5）对胚胎进行电穿孔。
   1. 使用拉针仪拉制硼硅酸盐玻璃毛细管（内径：0.6–0.8 mm）。拉制参数设置如下：P = 500，Heat = 560，Pull = 150，Vel = 75，Time = 250。用黑色墨水标记毛细管尖端，以便在注射过程中更清晰地观察。在体视显微镜下，使用直尺和尖头镊子修剪毛细管锥形部分，将尖端修剪至约6 mm长度。
   2. 保持毛细管的完整性，以确保实验的可重复性。修整时应制成单面斜面边缘，尖端应尽可能锋利，以便于穿透子宫壁并避免对胚胎组织造成损伤。
      注意： 或者，可使用微型研磨器将毛细管调整为35°角。毛细管可在无病原条件下，室温保存于10 cm培养皿中。
   3. 对手术器械进行高压灭菌。
   4. 将sgRNA质粒与pT2K-IRES-Luc以等体积混合，使每种质粒的终浓度至少为1 µg/µL，并用快绿染料对质粒溶液进行染色（终浓度为0.05%）。使用无内毒素的去离子....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高压灭菌带	Kisker Biotech	150262
电穿孔仪（方波）	BTX	ECM830
内毒素去除大提试剂盒	Qiagen	12362
乙醇	Merck	107017
眼膏（Bepanthen）	Bayer	81552983
快绿染料	Merck	104022
滤器（0.22 µm）	Merck	F8148
直头镊子	精细科学工具公司	91150-20
纱布（X100 ES垫片 8f 10 × 10 cm）	Fisher Scientific	15387311
带纤维丝的玻璃毛细管	Narishige	GD1-2
加热垫	ThermoLux	463265 / -67
异氟烷	Zoetis	TU061219
环形镊	精细科学工具公司	11103-09
体视显微镜	Nikon	C-PS
手术剪	精细科学工具公司	91460-11
钝头手术剪	精细科学工具公司	14072-10
带5 mm盘状铂电极的镊子	Xceltis  GmbH	CUY650P5
安乃近	WDT
非无菌丝线缝合线（0.12 mm）	精细科学工具公司	18020-50
PBS（1×）	Life Technologies	14190169
钝头组织剪（11.5 cm）	精细科学工具公司	14072-10
pCAG-EGxxFP	Addgene	50716
pX330 质粒	Addgene	42230