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所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 坐骨神经提取
- 取先前在坐骨神经中注射了癌细胞的小鼠，用 CO2 实施安乐死。将小鼠置于腹侧卧位，并用大头针固定远端肢体。
- 去除注射侧肢体及躯干背侧的皮肤。
- 采用钝性分离法，深入肌肉暴露坐骨神经。
- 坐骨神经走行于髂骨与骶骨之间。为进入脊髓区域的神经段，需分离这两块骨骼。首先将闭合的剪刀插入坐骨神经所在的狭窄区域，然后在固定小鼠的同时打开剪刀。操作需轻柔，在解剖过程中保持坐骨神经的完整性。
- 小心地向远端解剖坐骨神经至股骨末端，向近端解剖至脊髓。
注意： 受肿瘤侵袭的神经极为脆弱，容易在牵拉或用力操作下断裂。
- 首先切断神经的远端，以获取神经组织。在松解周围邻近组织的同时，小心提起神经；然后尽可能靠近神经自脊柱发出的位置，切断其近端。
- 使用游标卡尺记录肿瘤侵袭的宏观长度。该宏观测量值仅为参考性估计。
2. 神经组织的处理与定量分析
- 将解剖出的神经置于OCT包埋剂中，确保神经纵向放置，并尽可能平放在模具底部。
- 在包埋盒上标记神经的近端和远端，分别用字母 P（近端）和 D（远端）标明。
- 若不能立即切片，将包埋好的神经置于干冰上。样品可在 -80 °C 下保存数周。
- 使用冷冻切片机将样品切成 5 μm 厚度，并将切片置于玻璃载玻片上。如有可能，每张载玻片放置两个神经切片，并标明神经的近端方向。
- 采用 H&E 染色法对载玻片进行染色。
- 使用可提供高分辨率数字数据的切片扫描仪对染色后的神经切片进行数字化扫描。
- 利用图像分析软件，通过点击“测量距离”按钮，测量侵袭长度、侵袭面积或其他所需参数。为准确估算侵袭长度，建议使用同一神经的多个切片（2 至 4 个）进行分析。