斑马鱼胚胎中肿瘤细胞的长期原位移植：一种将肿瘤细胞高效递送至斑马鱼胚胎第四脑室以长期分析肿瘤细胞行为的方法

摘要

来源：Casey, M. J. 等。在免疫功能健全的宿主体内移植斑马鱼儿科脑肿瘤以长期研究肿瘤细胞行为和药物反应 J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了将斑马鱼脑肿瘤细胞原位移植到免疫健全的斑马鱼胚胎第四脑室的过程。该方法可实现对肿瘤细胞侵袭行为和长期动态的观察研究。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 将肿瘤悬液注射至2天受精龄胚胎的第四脑室

1. 使用移液管将10–20个去壳且已麻醉的胚胎转移至注射板边缘；胚胎应侧向落入注射板，使脑室清晰可见且易于操作。根据需要使用斜角探针调整胚胎位置，并将其置于注射板外缘以内。
2. 使用凝胶上样枪头将1–2 µL肿瘤细胞悬液吸入注射针头，然后将针头插入操纵器中。
3. 手动降低操纵器，使针头保持45°角。调节显微操作仪的x、y和z方向旋钮，使针头位于胚胎头部上方略偏右约5 mm处。通过体视显微镜目镜观察，缓慢调节显微操作仪的x方向，直至针头刺入胚胎第四脑室。注意避免针头刺入心脏或卵黄。
   1. 踩下连接显微注射仪的脚踏开关，注入肿瘤细胞悬液。
      注意：注射压力和时间取决于针头孔径，初始参数建议为5–10 PSI和50–100 ms。如需，可通过将液体注入矿物油并采用标准油滴法评估注射体积。通常，注射500 pL、液滴直径0.1 mm时效果最佳。
4. 用新鲜的卵水（反渗透水中含0.6 g/L水族盐 + 0.01 mg/L亚甲蓝）轻轻冲洗已注射的胚胎，使其从注射板流入培养皿中。后续操作期间或移入养殖缸前，均应将胚胎维持在卵水中。
5. 在荧光体视显微镜下检查已注射的胚胎。确认注射压力、角度、针头尺寸及细胞悬液黏度能使肿瘤细胞填充25–50%的脑室空间。根据需要调整上述参数。
6. 对剩余胚胎重复步骤1.1–1.5，必要时对额外胚胎进行麻醉。    
   注意：熟练操作者可在3–4小时内完成最多300个胚胎的注射。
7. 将胚胎放回28°C培养箱中过夜。
8. 次日，通过观察形态学和生理学特征（如正常的心脏和脑部发育）评估胚胎存活情况，方法如前所述。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
卵水	自配		胚胎维持，制备注射板
培养皿	Thermo Fisher	FB0875711Z	胚胎培养，制备注射板
玻璃容器	任意商用品牌		制备注射板
微量移液器	任意商用品牌		肿瘤重悬与移植
斜角探针	Fine Science Tools	10140-02	胚胎操作
转移移液管	任意商用品牌		胚胎操作
体视显微镜	Olympus	SZ61	肿瘤移植
荧光体视显微镜	Olympus	SZX16	成像肿瘤移植物
显微镜相机	Olympus	DP-72	成像肿瘤移植物
培养箱	任意商用品牌		维持胚胎，预热注射板
N2	任意商用品牌		用于显微注射仪设置
玻璃毛细管（无 filament）	World Precision Instruments	TW120-4	肿瘤移植
拉针仪	Sutter Instruments	P-97	肿瘤移植
微量加样吸头	Eppendorf	930001007	肿瘤移植
显微注射仪	Harvard Apparatus	PLI-90	肿瘤移植
Tricaine-S (MS-222)	Western Chemical	TRS1	肿瘤移植，麻醉剂
琼脂糖	Denville	CA3510-8	制备注射板
微波炉	任意商用品牌		制备注射板
天平	任意商用品牌		制备注射板
手套	任意商用品牌		实验方案的各个方面
蛋白酶 K（Pronase）	Roche Diagnostics	11459643001	去除胚胎的卵膜
刀片	Thermo Fisher	12640	针头制备
50 mL 烧杯（2 英寸直径）	任意商用品牌		制备注射板
玻璃容器	任意商用品牌		制备注射板
亚甲蓝	Sigma-Aldrich	M9140	添加至卵水中以防止真菌生长