小鼠模型中治疗性神经干细胞（NSCs）的鼻内递送：一种将携带溶瘤病毒的NSCs靶向递送至脑肿瘤小鼠模型的实验方法

摘要

来源：Yu, D. 等. 在小鼠模型中通过鼻内递送治疗性干细胞至胶质母细胞瘤。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了将携带溶瘤病毒的治疗性神经干细胞通过鼻内递送至脑肿瘤小鼠模型的方法。这种非侵入性的干细胞鼻内给药方式可绕过血脑屏障，促进干细胞向脑内肿瘤部位的递送，从而实现治疗目的。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 人神经干细胞的缺氧预处理（图1A）

1. 将培养的NSCs接种于T75培养瓶中，直至细胞融合度达到90%。
2. 将细胞培养瓶置于加湿的CO₂培养箱/孵育器中，通过由自动内置流量计控制的N₂气体供应，维持1% O₂浓度，持续24小时。此类细胞称为^HNSCs。对照组^NNSCs的制备方法如下：
   1. 在加湿、37 °C、含95%空气和5% CO₂的培养箱中，将人源NSCs（克隆株HB1.F3.CD）培养于含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中。

2. 人神经干细胞（NSCs）的溶瘤病毒加载（图1B-1H）

1. 用50个条件复制型腺病毒（CRAd-S-pk7）病毒颗粒/细胞感染^NNSCs和^HNSCs。
2. 室温孵育2小时，期间定期轻拍培养板，然后用培养基洗涤细胞三次，以去除未结合的病毒颗粒，并将细胞重悬于无菌生理盐水中用于注射。
   注意：所有与病毒相关的体外细胞培养操作均应在具有适当生物安全等级（如BSL2）的设施中进行。操作溶瘤病毒的研究人员必须根据机构动物设施的指南佩戴适当的个人防护装备。

3. 治疗性神经干细胞的鼻内递送（图1D 和 图2D）

1. 培养并收集NSCs（^NNSCs，^HNSCs）。
2. 通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪混合物对小鼠进行麻醉，操作步骤如下：
   1. 根据小鼠体重，使用经批准的试剂进行麻醉：可通过腹腔（i.p.）注射氯胺酮（50–100 mg/kg；具体剂量范围请参考所在机构IACUC批准的方案）和赛拉嗪（5–10 mg/kg；具体剂量范围请参考所在机构IACUC批准的方案）的混合物，溶于200–250 µL无菌生理盐水中；或使用吸入式麻醉装置给予4–5%异氟烷进行麻醉。
3. 将小鼠仰卧置于清洁的手术巾上，身下放置加热垫以维持体温。调整由卷起的纸巾并用胶带固定的软枕，将其置于小鼠头部下方，确保鼻孔保持垂直向上的角度。
4. 使用微量移液器，向每侧鼻孔滴加2 µL NSC悬液。在处理下一只小鼠前，需肉眼确认液滴已被吸入。细胞总接种数量由实验者确定；建议使用62,500–125,000个细胞/µL的浓度，通过4次每次2 µL的给药，共递送0.5–1×10⁶个细胞。
5. 使用计时器控制每次细胞悬液给药之间的间隔，每次间隔5分钟，最多给药4次。
6. 将动物置于恢复室中，保持仰卧位，直至其恢复自主活动能力。

结果

图1： 经鼻递送前干细胞制备的一般流程图。（A–C） 对干细胞进行缺氧预处理或基因改造以过表达CXCR4。 （B–D） 进行洗涤、酶解离、细胞收集和计数步骤，用于后续将治疗性或诊断性载荷加载至干细胞中。 （E） 可在适当浓度下，通过定期振荡和轻柔搅动，将治疗剂（如溶瘤病毒）或诊断示踪剂（如MPIO颗粒）加载到收集的干细胞中 （F）。 （G–I） 随后可对加载后的干细胞进行洗涤和计数，并用于小鼠的经鼻递送。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养耗材（塑料制品）	ThermoFisher Scientific	Varies	可替换为任意来源
Legend Micro 21R 制冷型微量离心机	ThermoFisher Scientific	75002490	可替换为任意来源
台式离心机 Sorvall ST16R 	ThermoFisher Scientific	75004240	可替换为任意来源