小鼠模型中治疗性神经干细胞 （NSC） 的鼻内递送:将载瘤病毒的 NSC 肿瘤靶向递送到荷瘤小鼠模型中的程序

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 人 NSC 的缺氧预处理（图 1A）

1. 在 T75 培养瓶中接种培养的 NSC，直至达到 90% 汇合。
2. 通过由自动内置流量计控制的 N₂ 供气，将细胞培养瓶放入保持 1% O₂ 水平的加湿 CO₂ 室/培养箱中 24 小时。这些细胞称为 ^HNSC。对照 ^NNSC 生成为:
   1. 在加湿的 37 °C 培养箱中，在 95% 室内空气和 5% CO₂ 下，将人 NSC（克隆 HB1.F3.CD）维持在含有 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 培养基中。

2. 溶瘤病毒对人 NSC 的负载（图 1B-1H）

1. 用 50 个条件复制腺病毒 （CRAd）-S-pk7 病毒颗粒/细胞感染 ^NNSCs、^HNSCs。
2. 在室温下孵育 2 小时并定期敲击后，用培养基洗涤细胞 3 次以去除未结合的病毒颗粒，并将细胞悬浮在无菌盐水中注射><。 谨慎:在具有适当生物安全等级名称（如 BSL2）的设施中执行所有与病毒相关的体外细胞培养程序。根据机构动物设施指南，处理溶瘤病毒的研究人员必须穿戴适当的个人防护装备。

3. 治疗性 NSC 的鼻内递送（图 1D 和图 2D）

1. 培养并收集 NSC （^NNSCs， ^HNSCs）。
2. 通过腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪混合物麻醉小鼠，根据程序:
   1. 使用批准的试剂根据体重麻醉动物，即通过腹膜内 （ip） 注射氯胺酮（50-100 mg/kg;批准剂量范围请咨询机构 IACUC）和甲苯噻嗪（5-10 mg/kg;批准剂量范围请咨询机构 IACUC）的混合物在 200-250 μL 无菌盐水中， 或使用吸入装置通过 4-5% 异氟醚麻醉。
3. 将小鼠面朝上放在干净的窗帘上，下面放上加热垫以保持体温。调整由卷起的纸巾和胶带制成的软垫枕头，以确保将鼠标放在鼠标头部下方时鼻孔的直立角度。
4. 使用微量移液器，将 2 μL NSC 悬液分配到小鼠的每个鼻孔中。在移动到下一个鼠标之前，目视确认液滴的吸液。递送的细胞总数可由用户确定;使用 62,500–125,000 个细胞/μL，这样就可以以 4 x 2 μL 的剂量输送 0.5–100 万个细胞。
5. 使用计时器确保每次细胞悬液给药之间间隔 5 分钟，最多 4 次。
6. 让动物在恢复室中恢复活动能力，并始终保持仰卧位。

图 1:鼻内给药前涉及的一般干细胞制备程序的流程图。（A-C）干细胞的缺氧预处理或基因修饰以过表达 CXCR4。（B-D）进行洗涤、酶解离、细胞收集和计数步骤，以便随后用治疗或诊断货物加载干细胞。（E） 治疗试剂，如溶瘤病毒，或诊断示踪剂，如 MPIO 颗粒，可以通过定期摇晃和温和搅拌 （F） 以适当浓度加载到收集的干细胞中。（G-I）然后可以洗涤加载的干细胞并计数以鼻内递送到小鼠体内。

图 2:涉及的一般动物程序的示意图流程图。（A） 通过患者来源的神经胶质瘤细胞的异种移植创建肿瘤模型。（B） 通过 BLI 监测肿瘤生长。（C） 仅进行头部照射治疗 （D） 在治疗性鼻内干细胞输送期间保持仰卧和头部倾斜姿势。（E） 必要时跟进治疗后生存监测、小动物成像和组织学分析。