微肿瘤的生成：一种用于培养三维微肿瘤以分析药物处理反应的体外培养技术

摘要

来源：Gilbert, A. N. 等. 利用三维人源生物凝胶培养系统和患者来源的胶质母细胞瘤细胞生成微肿瘤用于激酶组学分析和药物反应测试。J. Vis. Exp. (2016)

在本视频中，我们利用三维人类生物凝胶将患者来源的肿瘤细胞生成微肿瘤。这些微肿瘤高度模拟体内肿瘤微环境，可作为潜在的药物测试平台。

方案

1. 微肿瘤生成

1. 试剂的制备
   1. 向一瓶500 mL的Neurobasal培养基（NBM）中加入以下成分，配制完全NBM：10 mL不含维生素A的B-27添加剂、5 mL N2添加剂、100 µL EGF、100 µL碱性成纤维细胞生长因子（FGF-Basic）、5 mL两性霉素B、0.5 mL庆大霉素、5 mL L-谷氨酰胺，并根据内部方案制备中和的高密度人源生物凝胶（HuBiogel）（HDHG，3 mg/mL）。也可使用类似的生物凝胶基质。
2. 微肿瘤的生成与培养
   1. 将新鲜解离的PDX细胞以单细胞悬液形式置于冰上，使用完全NBM保存。
   2. 将细胞悬液与等体积的台盼蓝溶液（PBS中0.4%）混合，用血细胞计数板通过台盼蓝排斥法测定细胞数量和活力。根据所需生成每微肿瘤50,000个细胞的量，计算所需体积（体积 = (50,000 个细胞/肿瘤 × 肿瘤数量) / (每毫升活细胞数)），取相应体积细胞悬液转移至新的锥形管中。
   3. 在室温下以150 × g 离心8分钟浓缩细胞。弃去上清液，将细胞沉淀用预冷的HDHG溶液重悬，最终比例为1份含FBS的细胞与4份HDHG。
   4. 使用电子多通道移液器将10 µL细胞-HDHG混合液分配至96针钢制板（具有疏水....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胶原酶-I	Sigma-Aldrich	CO130
Neurobasal-A	Life Technologies	10888-022
N-2 补充剂	Life Technologies	17502-048	1x 终浓度
B-27 补充剂（不含维生素 A）	Life Technologies	12587-010	1x 终浓度
重组人碱性成纤维细胞生长因子	Life Technologies	PHG0266	最终浓度为 10 ng/mL
L-谷氨酰胺	康宁 Cellgro Mediatech	25-005-CI	终浓度 2 mM
庆大霉素	Life Technologies	15750-060	最终浓度为 50 ng/mL
台盼蓝	Pierce ThermoScientific	15250-061
高密度 Hubiogel	Vivo Biosciences	HDHG-5
DMSO	Fisher	BP231	用于溶解钙黄绿素 AM &和化合物
含钙/镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲液	康宁 Cellgro Mediatech	20-030-CV	用MiliQ超纯水稀释至1x（用于固定前洗涤）
10% 中性缓冲福尔马林	实验方案	032-060
100 毫米玻璃培养皿	Fisher	08-748D