利用SB介导的转座诱导胶质母细胞瘤：一种通过转座子介导的SB质粒整合至新生小鼠脑部以建立新型小鼠模型的技术

摘要

来源：Calinescu, A. A. 等 通过转座子介导将质粒DNA整合至新生小鼠侧脑室下区以构建新型胶质母细胞瘤模型。J. Vis. Exp. (2015)

本视频介绍了一种通过将转座子DNA注射到新生小鼠脑室中以高效诱导胶质母细胞瘤（GBM）的技术。位于脑室下区的细胞摄取质粒后发生转化、增殖，并形成具有人类GBM组织病理学特征的肿瘤。

方案

1. 新生儿脑室内注射

1. 实验前3至4周，将一只雄性小鼠和一只雌性小鼠放入一个鼠笼中，并放置一个彩色塑料小屋。这可提供丰富的环境，有助于交配过程。
2. 确认怀孕后，将雄鼠移至新笼中。交配后第18天起，每天观察笼内情况以监测分娩。在出生后第1天（P1）进行脑室内注射。
3. 注射液的制备。
   ​注意：注射液通过将质粒DNA与转染试剂混合形成转染颗粒。以下是以编码Sleeping Beauty转座酶和荧光素酶的质粒pT2/SB100x-Luc，以及两个转座子质粒pT/CAGGS-NRASV12和pT/CMV-SV40-LgT（比例为1:2:2）为例的注射液制备方法：所有质粒浓度均为2 µg/µL。
   1. 制备DNA溶液：加入4 µg（2 µL）pT2/SB100x-Luc、8 µg（4 µL）pT/CAGGS-NRASV12、8 µg（4 µL）pT/CMV-SV40-LgT以及10 µL 10%葡萄糖，定容至20 µL，最终DNA浓度为1 µg/mL，葡萄糖浓度为5%。
   2. 制备PEI溶液：加入2.8 µL体内jetPEI、7.2 µL无菌水和10 µL 10%葡萄糖，最终葡萄糖浓度为5%。
   3. 将PEI溶液加入DNA溶液中，混匀并涡旋，室温（RT）静置20分钟。此时溶液即可用于注射。室温放置超过一小时后，需将溶液置于冰上保存。
   4. 将配备30G斜面为12.5°的皮下注射针头的10 µL洁净注射器安装到微泵中（图1 #1）。
4. 为验证注射系统的正常功能，使用自动注射器（图1 #1）吸取10 µL水进入注射器，然后完全排空。
5. 用干冰与酒精混合物冷却新生小鼠立体定位仪（图1 #3），使其温度降至2–8°C。
6. 将幼鼠置于湿冰上2分钟以诱导麻醉。在后续操作过程中，麻醉作用将在冷却的立体定位架上持续维持。保持支架温度在冰点以上、2–8°C之间，可防止热损伤。作为特别预防措施，可在将幼鼠置于湿冰前用纱布包裹。
7. 用DNA/PEI溶液填充注射器。
8. 将幼鼠固定在立体定位架中，使其头部置于覆盖纱布的耳杆之间（图1b）。确保颅骨背侧水平，与支架表面平行，且颅缝清晰可见。用70%乙醇擦拭头部。
9. 降低注射器针头，调节立体定位坐标，直至针头接触λ点（顶骨与枕骨中线交点）（图1b）。
10. 抬起针头，将立体定位坐标调整至距λ点外侧0.8 mm、头侧1.5 mm处（图1b）。
11. 降低针头直至接触皮肤并轻微凹陷，记录坐标。再将针头下降1.5 mm，针头将穿透皮肤和颅骨，穿过皮层进入侧脑室（图1c）。
12. 使用自动注射器以0.5 µL/min的速度注入0.75 µL DNA/PEI溶液。
13. 将幼鼠继续留在支架上约1分钟，使溶液在脑室内充分扩散。在此期间，可将另一只幼鼠置于冰上麻醉2分钟，为下一次注射做准备。
14. 缓慢轻柔地提起针头，将幼鼠置于加热灯下。监测其呼吸和活动情况。如有必要，轻轻刺激四肢直至出现首次呼吸。
15. 待幼鼠体温恢复、肤色转为红润、呼吸规律且活动正常后（通常需5–7分钟），将其归还母鼠。若同时注射多只幼鼠，应将所有幼鼠集中在一起，直至全部注射完成。若注射过程超过30分钟，应在前30分钟结束后先归还一半幼鼠，其余在操作结束时归还。
16. 观察母鼠是否对幼鼠有反应并表现出哺育行为。如有需要，可在笼中添加代孕母鼠。
17. 确保幼鼠从置于冰上到移至加热灯下的时间少于10分钟。操作越迅速，存活率越高。通常，麻醉和注射一只幼鼠所需时间为4分钟。

结果

图 1：新生小鼠脑室内注射的实验装置与操作指南。(a) 立体定位仪框架（2）配备有微米刻度旋钮，并安装了一个持针器，夹持一支10 µl注射器（4）。在U形框架内，牢固固定了一个新生小鼠适配器框架（3）。自动注射器的控制面板（1）可精确设定注射器型号、注射体积和流速。(b) 一只新生小鼠（P1）的照片，显示针头已插入侧脑室注射所需的位置：位于人字缝前1.5 mm腹侧、0.8 mm外侧。(c) 新生小鼠（P1）脑部冠状切面示意图，突出显示脑室的相对大小与位置。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Stoelting公司标准型立体定位仪，配备大鼠和小鼠适配器	斯托尔丁	51670	其他公司也生产类似的框架，任何带有小鼠适配器的均可适用
核心立体定位注射仪（QSI）	斯托尔廷	53311	可以不使用它进行注射，但自动注射器可提高可重复性和操作便利性
10 μL 700 系列手动安装微量注射器	Hamilton	Model 701	该注射器型号的输送量为 0.5 至 500 μL 溶液的准确性。其他注射器（例如 5  μL，Model 75）也可使用
30 号皮下注射针头（1.25"，15°斜面	Hamilton	S/O# 197462	这种针头非常适合穿透新生小鼠的皮肤和颅骨，无需其他侵入性操作。如果针头变钝（难以刺入皮肤），则需要更换。
体内喷射PEI	Polyplus Transfection	201-10G	分装成小体积，于 -20 保存ºC
D-荧光素钾盐	Goldbio.com	LuckK-1g	其他来源的萤光素酶同样适用
苏木精溶液，改良 Harris 法	Sigma Aldrich	HHS128-4L