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所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。
1. 剖析
注意:除非容器用于细胞培养目的，否则不需要无菌条件。制备分离容器溶液:B1，加入 1.5 mL HEPES 1M 至 150 mL HBSS 中;B2，将 3.6 g 葡聚糖添加到 20 mL B1 中;B3，向 100 mL B1 中加入 1 g BSA。
- 准备一个装有 20 mL B1 的 150 mL 烧杯。保存在冰上并用封口膜覆盖以避免空气污染。
- 用浸泡在 1 mL 纯异氟醚中的小纸巾在引擎盖下深度麻醉小鼠，该纸巾加入笼子中。通过对脚趾捏没有反应来验证麻醉。通过颈椎脱臼杀死老鼠。
注意:这些步骤是按照国家和机构法规完成的。
- 可选:用 20 mL PBS 1x 进行心内灌注以消除血液内容物。
- 用手术刀从脖子到鼻子切开皮肤，然后将其拉开。用 PBS 1x 去除所有污染的毛发。
- 要打开头骨，首先将剪刀插入嗅球前方，然后打开剪刀将头骨分成两部分。
- 使用脑刮刀小心地取出大脑。从侧脑室中解剖出脉络丛，因为它们会污染血管准备。
注意:可选:最终制剂将包含实质和脑膜血管。如果不需要，可以剥去脑膜。
- 将大脑转移到装有冰上 B1 溶液的烧杯中。最多可以同时治疗 8 个大脑。
2. 脑组织匀浆
- 使用两把手术刀，手动用力敲打 B1 溶液中的大脑，随后获得约 2 毫米的小块。
- 使用自动化 Dounce 均质器对制备物进行均质化，以 400 rpm 的速度执行 20 次冲程。确保玻璃管保持在冰中，上下移动时 douncer 的上部处于溶液中，以防止形成气穴。如果制备了多个样品，则在每次均质之间用离子水清洗 douncer。
3. 容器净化
- 将匀浆转移到 50 mL 塑料管中，并在 4 °C 下以 2,000 x g 的速度离心 10 分钟。在血管沉淀的顶部会形成一个大的白色界面（主要是髓鞘）（如果未进行灌注，则为红色）。
- 丢弃上清液。容器颗粒和白色界面将保持连接在一起。加入 20 mL 冰冷的 B2 溶液，手动剧烈摇晃试管 1 分钟。
- 在 4 °C 下以 4,400 x g 进行第二次离心 15 分钟。髓鞘现在将在上清液表面形成一层致密的白色层。
- 握住管子并缓慢旋转，让上清液沿着管壁通过，小心地将髓鞘层从管壁上分离。用上清液弃去髓鞘。包含容器的颗粒仍然附着在管的底部。
- 用缠绕在 5 mL 塑料移液管上的吸收纸吸干管内壁，并去除所有残留液体，避免接触容器沉淀。将试管倒置在吸水纸上，以排出任何残留的液体。
- 用低结合吸头上下吹打，将沉淀悬浮在 1 mL 冰冷的 B3 溶液中，保持试管在冰上，然后再加入 5 mL B3 溶液。确保容器尽可能分散，不要形成聚集体。
4. 过滤
- 用 30 mL 冰冷的 B3 溶液在冰上准备一个烧杯。用封口膜覆盖以避免空气污染。
- 将 20 μm 网状过滤器放在贝克烧瓶顶部的改良过滤器支架上，并通过应用 10 mL 冰冷的 B3 溶液进行平衡。
- 将容器制备物倒在过滤器上，并用 40 mL 冰冷的 B3 溶液冲洗容器。
- 使用干净的镊子回收过滤器，并立即将其浸入装有 B3 溶液的烧杯中。轻轻摇晃过滤器，将容器从过滤器上拆下。
- 将烧杯内容物倒入 50 mL 塑料管中，并在 4°C 下以 2,000 x g 离心 5 分钟
注意:或者，可以将步骤 3.6 中的脑血管悬浮液过滤到 100 μm 网状过滤器上。在这种情况下，较大的容器优先保留在过滤器上，而流通液包含微血管（主要是毛细管），然后如上所述在 20 μm 网状过滤器上过滤。
- 将微血管沉淀重悬于 1 mL 冰冷的 B3 溶液中，并将其移液至 1.5 mL Eppendorf 管中。在 4 °C 下以 2,000 x g 离心 5 分钟。