分离小鼠脑血管：从小鼠脑组织样本中分离完整血管的实验方案

摘要

来源：Boulay, A. C. 等。小鼠脑血管的纯化。J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了从小鼠大脑中分离构成血脑屏障（BBB）的完整血管，以及神经元和胶质细胞的方法。所分离的血管可用于建立体外模型，以研究其在维持大脑稳态中的作用。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 解剖

注意：除非容器用于细胞培养，否则无需无菌条件。制备分离容器溶液：B1，将1.5 mL 1 M HEPES加入150 mL HBSS中；B2，将3.6 g葡聚糖加入20 mL B1中；B3，将1 g BSA加入100 mL B1中。

1. 在150 mL烧杯中加入20 mL的B1溶液，置于冰上，并用封口膜覆盖以防止空气污染。
2. 在通风橱内，将浸有1 mL纯异氟烷的小片滤纸放入小鼠笼中，使小鼠深度麻醉。通过夹捏脚趾无反应来确认麻醉效果，随后通过颈椎脱位处死小鼠。
   注意：上述操作均依照国家及机构相关规定执行。
3. 可选步骤：使用20 mL的1× PBS进行心内灌注，以清除血液成分。
4. 用手术刀从颈部至鼻部切开皮肤并将其剥离，用1× PBS去除所有残留毛发。
5. 为打开颅骨，首先将剪刀从前嗅球方向插入颅腔，然后张开剪刀将颅骨剪成两半。
6. 使用脑组织铲小心取出脑组织。从侧脑室中分离脉络丛，因其会污染血管制备样品。
   注意：可选步骤：最终制备物将包含实质和软脑膜血管。如不需要软脑膜，可将其剥离。
7. 将脑组织转移至盛有B1溶液并置于冰上的烧杯中。每次最多可同时处理8个脑组织。

2. 脑组织匀浆化

1. 使用两把手术刀，在B1溶液中手动用力敲打脑组织，随后获得约2 mm大小的小块组织。
2. 使用自动Dounce匀浆器对样品进行匀浆，以400 rpm的速度进行20次研磨。确保玻璃管保持在冰上，并且在上下移动时Dounce匀浆器的上部始终浸没在溶液中，以防止产生气泡。若需处理多个样品，每次匀浆之间需用去离子水清洗Dounce匀浆器。

3. 血管纯化

1. 将匀浆转移至一个50 mL塑料管中，在4 °C条件下以2,000 × g离心10分钟。管内会形成一层位于沉淀物上方的厚实白色界面层（若未进行灌注，则沉淀呈红色，主要为髓鞘成分）。
2. 弃去上清液。血管沉淀物与白色界面层将仍粘附在一起。加入20 mL冰冻B2溶液，手动剧烈振荡管子1分钟。
3. 进行第二次离心，在4 °C条件下以4,400 × g离心15分钟。此时髓鞘将在上清液表面形成一层致密的白色层。
4. 手持试管并缓慢旋转，使上清液沿管壁流动，从而小心地将髓鞘层从管壁上分离。将髓鞘随上清液一同弃去。含有血管的沉淀物仍附着在试管底部。
5. 用包裹在5 mL塑料移液管上的吸水纸轻拭试管内壁，吸除所有残留液体，注意避免触碰血管沉淀物。将试管倒置放在吸水纸上，以排尽剩余液体。
6. 使用低吸附枪头在冰上反复吹打，将沉淀物重悬于1 mL冰冻B3溶液中，然后加入另外5 mL B3溶液。确保血管尽可能分散，避免形成团块或聚集。

4. 过滤

1. 在冰上准备一个烧杯，加入30 mL冰冻的B3溶液，并用封口膜覆盖以避免空气污染。
2. 将一个20 μm孔径的滤网置于改装过的滤器支架上，并放置在锥形瓶顶部，用10 mL冰冻的B3溶液进行平衡。
3. 将血管制备物倒入滤网上，并用40 mL冰冻的B3溶液冲洗血管。
4. 用洁净的镊子取出滤网，立即浸入盛有B3溶液的烧杯中。通过轻轻摇动使血管从滤网上脱落。
5. 将烧杯内容物倒入一个50 mL塑料离心管中，在4°C下以2,000 ×g离心5分钟。
   注意： 或者，也可将步骤3.6得到的脑血管悬液先过滤至100 μm孔径滤网上。在此情况下，较大的血管优先保留在滤网上，而滤过液中含有微血管（主要是毛细血管），随后按上述方法将滤过液再经20 μm孔径滤网过滤。
6. 将微血管沉淀物重悬于1 mL冰冻的B3溶液中，用移液器转移至1.5 mL离心管中，在4 °C下以2,000 × g离心5分钟。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
组织研磨器尺寸 C	Thomas Scientific	3431E25
Centrifuge 5415 R Eppendorf
Centrifuge 5810 R Eppendorf 5811000320
高性能模块化体视显微镜	Leica MZ6
低吸附吸头（P1000）Sorenson BioScience 14200T
Swinnex 47 mm 滤器支架 聚丙烯材质 8 个/包	Millipore	SX0004700
尼龙网滤膜 圆片 亲水性 20 μm 47 mm 100 片/包	Millipore	NY2004700
尼龙网滤膜 圆片 亲水性 100 μm 47 mm 100 片/包	Millipore	NY1H04700
PARAFILM M（卷装规格 4 英寸 × 125 英尺）	Sigma	P7793-1EA
HBSS，不含钙、不含镁、不含酚红	Life Technology	14175-129
HEPES (1 M)	Life Technology	15630056
右旋糖酐（来源于 Leuconostoc spp.），分子量约 70,000	Sigma	31390
牛血清白蛋白	Sigma	A2153
10× PBS	Euromedex	ET330