体外吞噬功能检测：一种基于活细胞成像的实时星形胶质细胞介导突触体吞噬作用研究方法

摘要

来源：Byun, Y. G., Chung, W. S. 利用pH指示剂标记的突触体进行星形胶质细胞介导的吞噬作用的新型体外活细胞成像检测方法 J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们通过活细胞成像实验评估体外纯化星形胶质细胞的吞噬能力。该实验可作为有效的筛选平台，用于鉴定能够增强或抑制星形胶质细胞吞噬能力的化学化合物。

方案

1. 吞噬作用活体成像实验（图1）

1. 准备一个24孔板（或任何适用于活细胞成像的孔板/培养皿），其中星形胶质细胞已达到汇合状态（通常在纯化后培养7至10天为最佳，有利于细胞状态稳定）。
2. 吸除每孔中的培养基，并用1 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤每孔三次。为尽量减少空气暴露，应快速完成洗涤操作。
3. 向每孔中加入300 µL免疫筛选星形胶质细胞基础培养基（IP-ABM），并加入5 µL pH指示剂偶联的突触体，以及如免疫筛选星形胶质细胞条件培养基（IP-ACM）等可调节胶质细胞吞噬作用的其他因子。
4. 将孔板置于CO₂培养箱中孵育40分钟。此步骤可使pH指示剂偶联的突触体沉降至孔板底部。
5. 吸除含有未结合pH指示剂偶联突触体的培养基，并用1 mL DPBS洗涤每孔三次。
   注意：避免剧烈洗涤。为尽量减少空气暴露，应快速完成洗涤操作。
6. 向每孔中加入500 µL含待测因子的IP-ABM。
7. 将孔板转移至活细胞成像仪器，选择成像位置，并调节焦距、曝光时间、亮度和LED功率。
   说明：曝光时间、亮度和LED功率的设置需根据荧光强度和实验目的进行调整。在使用pH指示剂偶联突触体的活细胞成像实验中，我们通常将这些参数设置如下：曝光时间：约150–200 ms，亮度：15，LED功率：4–6。
8. 设置活细胞成像的图像格式、时间间隔和总循环次数。根据所选成像位置的数量，将时间间隔设为1或2小时。当选择超过150个成像位置时，建议采用2小时的时间间隔。
9. 开始活细胞成像实验。

结果

图1. 吞噬作用活体成像实验示意图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pHrodo 红色，琥珀酰亚胺酯 	Molecular Probes	 P36600	用于 pH 指示剂偶联
胎牛血清（FBS） 	Gibco	16000-044
DMEM	Gibco	11960-044
dPBS	Welgene 	LB001-02
<strong>吞噬作用活细胞成像检测</strong>
Juli 培养箱&nbsp;	NanoEntek
Time Series Analyzer V3 插件&nbsp;	https://imagej.nih.gov/ij/plugins/ time-series.html