离体电穿孔法转染鸡胚小脑切片：一种通过导入编码绿色荧光蛋白的质粒DNA以可视化颗粒细胞发育的方法

摘要

来源：Hanzel, M. 等. 鸡小脑切片的离体培养及颗粒细胞前体的定位靶向电穿孔。 J. Vis. Exp. (2015)

在本视频中，我们对鸡胚小脑切片进行报告基因质粒的电穿孔转染。该技术有助于可视化颗粒细胞前体的发育及其迁移以形成颗粒层的过程。

方案

1. 脑片电穿孔

1. 使用绝缘胶带将电穿孔仪的阳极固定在60 mm培养皿的底部，构建一个电穿孔腔室。加入约1 mL的HBSS以覆盖电极。
2. 将一个0.4 µm的培养插件放置在被HBSS覆盖的电极上方。让培养插件静置于电极上，确保插件与电极之间始终保持接触。
   注意：在此装置中，带有脑片的培养插件将浮于溶液表面，保持电路连通的同时允许对阴极进行空间定位。
3. 使用切去尖端的3 mL巴斯德移液管，将已识别的脑片（每个培养插件最多五片）转移至培养插件上，并分开放置，使其呈矢状面方向自然沉降。
4. 使用移液器去除多余的HBSS，使脑片不再浸泡在溶液中。
5. 使用P10移液器吸头，在脑片目标区域表面滴加DNA（浓度为1 µg/µL），该DNA用20%快绿染料稀释。20%快绿可增加DNA溶液的黏度，防止DNA过度扩散。每片脑片约加入5 µL DNA/快绿混合液（图1B）。
6. 将阴极置于所需靶组织上方，以3次10 V、持续10毫秒的脉冲进行电穿孔。避免阴极与组织直接接触，而是利用液体的表面张力维持导电性（将阴极尽可能靠近组织，但不实际接触组织）。
7. 根据需要，在每一片小脑脑片的外颗粒层（EGL）多个区域重复进行DNA递送和电穿孔操作。
8. 电穿孔完成后，将培养插件转移至30 mm培养皿中。

结果

图 1. 电穿孔室的装置示意图。（A）定制电穿孔室的照片。该装置由一个固定在60 mm培养皿底部的电穿孔仪阳极组成。培养皿中加入约1 mL HBSS以覆盖电极。培养插件应稳定放置在电极上，确保插件与电极之间持续接触，以维持电路导通，同时允许手动操控阴极以实现空间定位。（B）正在进行电穿孔的脑片照片。脑片表面覆盖有DNA/快绿溶液。可根据需要对脑片进行电穿孔：电穿孔可靶向单个小叶或多个位置。电穿孔完成后，将插件转移至含有预温培养基的30 mm培养皿中，并置于培养箱内进行培养。1. 阳极；2. 阴极；3. 培养插件；4. 含1 mL HBSS的培养皿；5. 解剖显微镜；6. 组织切片机获得的单个脑片；.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
巴斯德培养基 Eagle（Gibco）	 Life Technologies	 41010-026
L-谷氨酰胺	 Sigma	 G7513
青霉素/链霉素	 Sigma	 P4333
0.4 μm 培养小室	 Millipore	 PICM0RG50
TSS20 Ovodyne 电穿孔仪	 Intracel	 01-916-02	电穿孔时使用 3 次 10 V、10 毫秒的脉冲。