小脑解剖与切片制备：从小鼠小脑生成组织切片的方法

摘要

来源：Thetiot, M. 等. 髓鞘化脑片器官型培养物的制备与免疫染色。J. Vis. Exp. (2019)

本视频介绍了一种从小鼠小脑制备组织切片的方法。这些小脑切片可用于器官型培养，以研究神经发育机制，包括髓鞘形成的动态过程。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 小脑解剖与切片制备（实际操作时间 ≈ 每只动物15–20分钟）

1. 将一个含有冰冻解剖介质的 60 mm 细胞培养皿置于体视显微镜下，移除顶部盖板。
2. 用 70% 乙醇擦拭头部毛发（注意避免接触动物眼睛），然后按照批准的操作程序使用大号锋利剪刀将动物断头。
   注意： 小脑切片来源于 P9–P10 阶段的小鼠，无特定性别或品系偏好。
3. 使用小剪刀从颈部开始沿头部中线剪开皮肤，一直延伸至小鼠口鼻部。
4. 为固定头部并暴露颅骨，将皮肤向腹侧翻开至头部下方，并用手指捏住两侧皮肤褶皱。
5. 将小剪刀轻轻插入枕骨大孔，向一侧做一侧向切口，然后沿整个颅骨周围剪开。剪切时应尽量使剪刀尖端与颅骨平行并紧贴颅骨，以避免损伤脑组织。
6. 使用精细直镊取出颅骨的背侧部分。在小心抬起背侧颅骨时，如需要可用小剪刀剪断附着的脑膜（即包围脑组织的透明灌注膜），以避免损伤脑组织。
7. 将精细直镊（或可选用解剖刀）小心插入腹侧颅骨与脑组织之间，轻柔地将脑组织翻出，并用小剪刀剪断视神经和三叉神经。
8. 将头部倒置在培养皿上方，借助重力使脑组织自然落入含有冰冻解剖介质的 60 mm 细胞培养皿中；如有必要，可用小剪刀剪断最后的粘连组织。
9. 使用精细镊子将脑组织调整为背侧朝向研究者、腹侧朝下贴于培养皿底部的位置。
10. 在体视显微镜下，使用精细直镊固定前脑一侧的脑组织，避免触碰可能易损的后脑。使用精细直镊将后脑（包括小脑和脑桥）与其余脑组织（前脑和中脑，见图 1Aa示意图）分离。为从小脑下方的其余后脑结构中分离小脑，使用精细镊子剪断小脑脚（见图 1Aa’示意图）。
11. 小脑分离后，使用精细直镊小心撕除脑膜（见图 1Aa’示意图）。
12. 用精细弯镊轻轻夹住小脑，将其背侧朝上垂直放置于切片机刀片旁的塑料平台上（见图 1Bb示意图）。
13. 使用连接在 1 mL 移液器上的无菌细尖移液头，吸除小脑周围的过量解剖介质（见图 1Bb示意图）。
14. 确保小脑放置于平台时保持平坦但未被拉伸，以获得最佳的矢状切片效果（见图 1Bb示意图）。
15. 使用组织切片机切割厚度为 300 μm 的小脑矢状切片（见图 1Bb’示意图）。刀片的力度与速度需根据实际情况现场优化。
16. 在切好的小脑上轻轻滴加一滴解剖介质。使用连接在 1 mL 移液器上的宽口移液头，缓慢吸取切好的小脑，并将其转移回含有冰冻解剖介质的 60 mm 细胞培养皿中（见图 1Bb’’示意图）。
17. 每次完成小脑切片后，使用 100% 乙醇清洁切片机的塑料平台。待乙醇完全挥发后再将下一个小脑置于平台上。
18. 使用两把精细直镊（或可选用钛针）分离单个切片，并从中挑选 6–8 片来自蚓部的切片（见图 1Cc和图 1Cc’示意图）。
19. 取一个含培养插件的 6 孔板，使用连接在 1 mL 移液器上的宽口移液头，将最多 4 片选定的切片连同少量解剖介质转移至一个培养插件中（见图 1Cc’示意图）。
20. 利用解剖介质或镊子轻柔推动或拉动切片，将其置于培养插件中央，避免切片彼此接触（见图 1Cc’示意图）。
21. 使用细尖移液头去除切片周围的过量解剖介质。确保切片平整地贴附在膜上（见图 1Cc’示意图）。
22. 在将切片放置于膜上后，立即将 6 孔板放入培养箱中。

结果

图1： 小脑切片制备示意图。解剖过程分为三个主要步骤。(A) 分离小脑并去除脑膜（步骤1.10和1.11）。(B) 将小脑转移至切片平台并进行切片（步骤1.12至1.16）。(C) 最后，从小脑蚓部分离切片并置于膜插件上。移除随切片转移的解剖液后，将6孔板放入培养箱中（步骤1.18和1.22）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BME 培养基	ThermoFisher Scientific	41010026
Hank’s 平衡盐溶液 (10x HBSS)	ThermoFisher Scientific	14180046
GlutaMAX (100x)	ThermoFisher Scientific	35050038
热灭活马血清	ThermoFisher Scientific	26050088
青霉素–链霉素 (10,000 IU/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
Gey’s 平衡盐溶液	Sigma Aldrich	G9779-500ML
D-葡萄糖溶液 (45%)	Sigma Aldrich	G8769-100ML
多聚甲醛 (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15714
无水乙醇 (100% 乙醇)	VWR Chemicals	20821.33
Triton® X-100	Sigma Aldrich	X100-500ML	-20°C 冷却保存
10% 正常山羊血清 (NGS)	ThermoFisher Scientific	500622
磷酸盐缓冲液	EuroMEDEX	ET330-A
组织切片机	McIlwain		pH 7.4
剃刀刀片
大剪刀	F.S.T	14101-14
小剪刀	F.S.T	91500-09
直头精细镊子	F.S.T	91150-20
弯头精细镊子	F.S.T	11297-00
细胞培养皿 (60 mm 和 100 mm)	TPP
4 孔和 6 孔培养板	TPP
Millicell 培养插件 (0.4 µm，30 mm 直径)	Merck Millipore	PICM0RG50
细胞培养孵箱
细尖移液器吸头	Dutscher	134000CL	37&deg;C，5% CO<sub>2</sub>
宽口移液器吸头	ThermoFisher Scientific	2079G
无菌注射器	Terumo Europe
无菌注射器滤器	Terumo Europe		20 或 50 mL
手术刀	Swann-Morton	510	0.22 &micro;m
刷子
显微镜载玻片	RS France
玻璃盖玻片	RS France		76 mm × 26 mm × 1.1 mm
Kimtech 科学擦拭纸	Kimberly-Clark Professional	5511	22 mm × 22 mm
双目显微镜