脑片器官型培养中的单细胞电穿孔：一种在体外将质粒递送至脑海马切片中特定神经元的实验技术

摘要

来源：Keener, D. G. 等 在不同类型的鼠类海马兴奋性及类别特异性抑制性神经元脑片培养中进行单细胞电穿孔。 J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了在多种体外海马脑片培养物中，对兴奋性和抑制性神经元进行单细胞电穿孔转染基因的实验方案。该技术可用于研究神经元的特定分子和生理功能，包括细胞自主机制以及跨突触蛋白相互作用。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 切片培养物制备

1. 使用出生后6至7天的任一性别的小鼠制备小鼠海马脑片器官型培养。
   1. 制备用于器官型脑片培养的解剖液，成分如下（单位为 mM）：238 蔗糖、2.5 KCl、1 CaCl₂、4 MgCl₂、26 NaHCO₃、1 NaH₂PO₄ 和 11 葡萄糖，溶于去离子水中，然后用 5% CO₂/95% O₂ 混合气体饱和，调节 pH 至 7.4。
   2. 制备器官型脑片培养液，成分如下：78.8%（v/v）Eagle 最低必需培养基、20%（v/v）马血清、17.9 mM NaHCO₃、26.6 mM 葡萄糖、2 M CaCl₂、2 M MgSO₄、30 mM HEPES、胰岛素（1 µg/mL）和 0.06 mM 抗坏血酸，调节 pH 至 7.3。使用渗透压计将渗透压调节至 310–330 osmol。
   3. 使用两把刮铲从全脑中分离出海马组织，用组织切片机切成 400 µm 厚的切片。用两把镊子分开切片，并转移至置于6孔板内的30 mm细胞培养插件中，插件下方的培养板孔中加入培养液（950 µL）。
2. 将器官型脑片培养物置于组织培养孵育箱（35°C，5% CO₂）中保存，并每两天更换一次培养液。

2. 质粒制备

1. 准备目的基因的质粒。
   1. 将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因亚克隆至 pCAG 载体中。
   2. 使用无内毒素质粒纯化试剂盒纯化 pCAG-EGFP 质粒，并溶于内液中，内液成分为含 140 mM 钾甲磺酸盐、0.2 mM EGTA、2 mM MgCl₂ 和 10 mM HEPES 的焦碳酸二乙酯处理水，用 KOH 调节至 pH 7.3（质粒浓度：0.1 µg/µL）。

3. 玻璃移液管的制备

1. 使用微量移液器拉制仪拉制硼硅酸盐玻璃移液管（4.5–8 MΩ）（图1A）。
   注意：用于全细胞膜片钳记录的玻璃移液管非常适合进行电穿孔。
2. 将玻璃移液管在200°C下烘烤过夜以灭菌。
3. 在解剖显微镜下检查移液管尖端的尺寸，以估算其电学电阻。
   1. 可选：将移液管连接至电穿孔电极，并使用显微操作器将移液管尖端置入经过滤除菌的人工脑脊液（aCSF）中，通过读取电穿孔仪的显示值来验证移液管电阻。人工脑脊液的成分（单位：mM）如下：119 NaCl、2.5 KCl、0.5 CaCl₂、5 MgCl₂、26 NaHCO₃、1 NaH₂PO₄ 和 11 葡萄糖，溶于去离子水中，并用5% CO₂/95% O₂混合气体饱和，调节pH至7.4。使用电穿孔仪读数确认实际电阻值。
      注意：移液管尖端越尖锐，其电学电阻越大。移液管电阻应低于10 MΩ。高电阻的玻璃移液管（图1B）在重复电穿孔过程中常出现尖端堵塞现象。

4. 电穿孔装置设置

1. 将电穿孔仪安装至标准的全细胞电生理装置上，该装置配备有安装在移动台上的直立显微镜、微操纵器以及蠕动泵。
2. 将电穿孔仪的前置放大器安装到微操纵器上，并将一对扬声器连接至电穿孔仪。将电穿孔仪连接至脚踏开关，以便准备就绪时发送脉冲。
   注意： 扬声器在开启时会发出提示音，该声音可反映电极处的电学电阻情况。由此可在不转移操作注意力的情况下判断电阻的相对变化。

5. 电穿孔准备

1. 将脑片培养插件从6孔板转移至含有900 µL培养基的3 cm培养皿中，并置于台式CO₂培养箱内，待进行电穿孔操作时取出。
   1. 将新的培养插件预先用脑片培养基（1 mL）在3.5 cm培养皿中预孵育至少30分钟，用于电穿孔后脑片的培养。
2. 清洁并准备电穿孔装置。
   1. 实验当天开始前，用10%次氯酸钠溶液灌流管路5分钟，以对管路和腔室进行灭菌。
   2. 随后用去离子灭菌水灌流管路至少30分钟，彻底冲洗。
   3. 最后用滤膜除菌的含0.001 mM河豚毒素（TTX）的人工脑脊液（aCSF）灌流管路。
      注意：TTX可最大限度减少因中间神经元过度兴奋导致的细胞毒性及细胞死亡。
3. 设置电穿孔仪的脉冲参数：电压幅度为–5 V，方波脉冲，脉冲串持续时间为500 ms，频率为50 Hz，脉冲宽度为500 µs。
4. 用5 µL含质粒的内液填充玻璃移液管。
   1. 通过轻弹及多次轻轻敲击移液管尖端，去除其中可能存在的气泡。
   2. 在解剖显微镜下观察尖端是否有损伤，或重复步骤3.3.1检测移液管电阻以确认其状态。
      注意：若尖端受损，必须丢弃该玻璃移液管，并使用步骤3中先前制备的新移液管重复本步骤。
5. 将移液管牢固地连接至电极，并打开扬声器。当移液管尖端接触aCSF培养基时，记录电穿孔仪的读数（即移液管的电阻值）。
6. 使用锋利刀片切割培养插件膜，分离出一片脑片培养物。使用尖头弯镊小心地将脑片转移至电穿孔腔室，并用脑片固定器固定其位置。
   1. 单次操作中，脑片在培养箱外停留时间不得超过30分钟，以避免神经元健康或功能发生改变等不良影响。

6. 对目标细胞进行电穿孔

1. 使用口部或连接在管路上的1 mL注射器（施加0.2–0.5 mL压力）向移液管施加正压。
2. 利用显微操作仪的三维旋钮控制系统，将移液管尖端移动至组织切片培养物表面附近。
3. 选择一个目标细胞并靠近它，在显微镜下观察到细胞表面形成凹陷之前，持续施加正压。
4. 执行压力循环。
   1. 通过口部快速施加轻微负压，使移液管尖端与细胞质膜之间形成松密封，此时可在显微镜下观察到膜部分进入移液管尖端。通过监听扬声器发出的声音音调升高，观察到移液管电阻增加（约为初始电阻的2.5倍）。随后迅速重新施加正压，使细胞表面再次形成凹陷。
   2. 立即连续完成至少两次以上的压力循环，中间不停顿，然后持续施加负压1秒。
      注意：在循环之间停顿、施加过大的压力或负压持续时间过长，可能导致细胞严重损伤，甚至在电穿孔过程中死亡。
5. 当扬声器发出的声音音调达到稳定峰值（表明电阻达到峰值）时，立即用脚踏开关触发一次电穿孔脉冲。在达到峰值电阻后，不得超过1秒才发出脉冲。
   注意：采用本方案时，我们未观察到脱靶电穿孔现象。只有在压力循环期间与玻璃移液管接触的细胞才会被转染。将移液管置于其他神经元附近不会导致基因转染。
6. 在不施加压力的情况下，轻轻将移液管从细胞撤回约100 µm。
7. 重新施加正压，确认电阻值与步骤5.5中记录的读数相近，然后接近下一个细胞。
   1. 若电穿孔后出现可见堵塞或移液管电阻显著升高（>15%），可通过施加正压清除潜在堵塞。
      注意：若无可见堵塞但电阻仍显著升高，应丢弃该移液管并更换新的。通常情况下，若操作谨慎，一根移液管最多可用于20次电穿孔操作。

电穿孔后，将脑片培养物转移至新的培养插件上，在35°C培养箱中孵育最多3天。

结果

图 1：两个典型的玻璃移液管图像。 （A）显示本方案中使用的低电阻移液管（6.5 MΩ），以及（B）典型用于电穿孔方案的高电阻移液管（10.4 MΩ）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<strong>质粒制备</strong>
质粒纯化试剂盒	Qiagen	12362
<strong>器官型脑片培养制备</strong>
6孔板	GREINER BIO-ONE	657160
Dumont #5/45 镊子	FST	#5/45	用于器官型脑片培养制备的弯头解剖镊
滤器瓶装置	Millipore	SCHVU02RE	培养基的过滤与储存
培养箱	Binder	BD C150-UL
McIlwain 组织切片机	TED PELLA, INC.	10180	用于器官型脑片培养制备的组织切片设备
Millicell 细胞培养插件，30 mm	Millipore	PIHP03050	器官型脑片培养插件
渗透压计	Precision Systems	OSMETTE II
聚四氟乙烯涂层刮勺	Cole-Parmer	SK-06369-11
剪刀	FST	14958-09
体视显微镜	Olympus	SZ61
无菌真空过滤系统	Millipore	SCGPT01RE	aCSF 的过滤与储存
<strong>电极制备</strong>
毛细玻璃管	Warner Instruments	640796
微电极拉制仪	Sutter Instrument	P-1000	拉制仪
烘箱	Binder	BD (E2)
拉制仪灯丝	Sutter Instrument	FB330B	拉制仪
3.5 mm Falcon 培养皿	BD Falcon	353001
防震台	TMC	63-7512E
CCD 相机	Q Imaging	Retiga-2000DC	相机
电穿孔系统	Molecular Devices	Axoporator 800A	电穿孔仪
荧光照明系统	Prior	Lumen 200
显微操作器	Sutter Instrument	MPC-385	操作器
Metamorph 软件	Molecular Devices		图像采集
蠕动泵	Rainin	Dynamax, RP-2	灌流泵
移动平台	Luigs &amp; Neuman	240 XY
扬声器	未知		连接至电穿孔仪的扬声器
体视显微镜	Olympus	SZ30
台式培养箱	Thermo Scientific	MIDI 40
upright 显微镜	Olympus	BX61WI