脑片器官型培养中的单细胞电穿孔：一种在体外将质粒递送至脑海马切片中特定神经元的实验技术

摘要

来源：Keener, D. G. 等 在不同类型的鼠类海马兴奋性及类别特异性抑制性神经元脑片培养中进行单细胞电穿孔。 J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了在多种体外海马脑片培养物中，对兴奋性和抑制性神经元进行单细胞电穿孔转染基因的实验方案。该技术可用于研究神经元的特定分子和生理功能，包括细胞自主机制以及跨突触蛋白相互作用。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 切片培养物制备

1. 使用出生后6至7天的任一性别的小鼠制备小鼠海马脑片器官型培养。
   1. 制备用于器官型脑片培养的解剖液，成分如下（单位为 mM）：238 蔗糖、2.5 KCl、1 CaCl₂、4 MgCl₂、26 NaHCO₃、1 NaH₂PO₄ 和 11 葡萄糖，溶于去离子水中，然后用 5% CO₂/95% O₂ 混合气体饱和，调节 pH 至 7.4。
   2. 制备器官型脑片培养液，成分如下：78.8%（v/v）Eagle 最低必需培养基、20%（v/v）马血清、17.9 mM NaHCO₃、26.6 mM 葡萄糖、2 M CaCl₂、2 M MgSO₄、30 mM HEPES、胰岛素（1 µg/mL）和 0.06 mM 抗坏血酸，调节 pH 至 7.3。使用渗透压计将渗透压调节至 310–330 osmol。
   3. 使用两把刮铲从全脑中分离出海马组织，用组织切片机切成 400 µm 厚的切片。用两把镊子分开切片，并转移至置于6孔板内的30 mm细胞培养....

结果

图 1：两个典型的玻璃移液管图像。 （A）显示本方案中使用的低电阻移液管（6.5 MΩ），以及（B）典型用于电穿孔方案的高电阻移液管（10.4 MΩ）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<strong>质粒制备</strong>
质粒纯化试剂盒	Qiagen	12362
<strong>器官型脑片培养制备</strong>
6孔板	GREINER BIO-ONE	657160
Dumont #5/45 镊子	FST	#5/45	用于器官型脑片培养制备的弯头解剖镊
滤器瓶装置	Millipore	SCHVU02RE	培养基的过滤与储存
培养箱	Binder	BD C150-UL
McIlwain 组织切片机	TED PELLA, INC.	10180	用于器官型脑片培养制备的组织切片设备
Millicell 细胞培养插件，30 mm	Millipore	PIHP03050	器官型脑片培养插件
渗透压计	Precision Systems	OSMETTE II
聚四氟乙烯涂层刮勺	Cole-Parmer	SK-06369-11
剪刀	FST	14958-09
体视显微镜	Olympus	SZ61
无菌真空过滤系统	Millipore	SCGPT01RE	aCSF 的过滤与储存
<strong>电极制备</strong>
毛细玻璃管	Warner Instruments	640796
微电极拉制仪	Sutter Instrument	P-1000	拉制仪
烘箱	Binder	BD (E2)
拉制仪灯丝	Sutter Instrument	FB330B	拉制仪
3.5 mm Falcon 培养皿	BD Falcon	353001
防震台	TMC	63-7512E
CCD 相机	Q Imaging	Retiga-2000DC	相机
电穿孔系统	Molecular Devices	Axoporator 800A	电穿孔仪
荧光照明系统	Prior	Lumen 200
显微操作器	Sutter Instrument	MPC-385	操作器
Metamorph 软件	Molecular Devices		图像采集
蠕动泵	Rainin	Dynamax, RP-2	灌流泵
移动平台	Luigs &amp; Neuman	240 XY
扬声器	未知		连接至电穿孔仪的扬声器
体视显微镜	Olympus	SZ30
台式培养箱	Thermo Scientific	MIDI 40
upright 显微镜	Olympus	BX61WI