脊髓神经元分离：一种用于体外研究的新生大鼠脊髓神经元密度梯度分离方法

摘要

[在此处插入FIGURE1]

图 1:3 天龄新生小鼠的脊柱解剖和脊髓释放。（a） 中的箭头指向脊柱的尾端，在那里插入针头以释放脊髓。释放的脊髓 （b） 浸没在 PBS 中。

[在此处插入FIGURE2]

图 2:离心后添加细胞的密度梯度。这些图层被勾勒出来，并在卡通描绘上更好地可视化。最浅层 （0） 通常是脊髓组织的碎片。第 1 层富含少突胶质细胞和星形胶质细胞。第 2 层和第 3 层包含大多数神经元。虽然第 3 层包含纯度最高的神经元，但在第 2 层中发现了一些支持细胞（即星形胶质细胞和少突胶质细胞）。底部的沉淀主要含有小胶质细胞。

摘要

来源：Eldeiry, M. 等。 新生小鼠脊髓神经元的分离与培养。J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，我们详细描述了一种从新生小鼠分离脊髓神经元用于体外研究的逐步实验方案。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 脊髓的采集

注意：所有器械均应进行高压灭菌（135 °C、30 psi，4 次循环，每次 7 分钟）以确保无菌。

1. 将1至3日龄的C57BL/6小鼠幼崽置于异氟烷麻醉舱中实施安乐死。在动物停止活动后等待30秒，并轻捏腿部以确认无反应。
2. 将小鼠俯卧固定，使用剪刀分离头部与躯体。
3. 将小鼠的后肢或尾部及前肢固定在操作台上，使背部朝向操作者。
4. 使用弯头虹膜剪剪除皮肤。
5. 从髋部上方的腰段开始切断脊髓，并沿胸腔两侧剪开，将脊柱部分与躯体分离。
   注意：此步骤需小心分离脊髓与内脏器官，以避免意外损伤其他组织（图1a）。
6. 将组织依次浸入三个盛有5 mL经0.2 μm滤膜过滤除菌的磷酸盐缓冲液（PBS）的10 cm培养皿中，每皿洗涤10秒，以去除多余组织。
7. 将装有5 mL过滤除菌PBS的22G针头和注射器插入脊柱尾端，向头侧冲洗，使脊髓冲出并落入第四个培养皿中（图1b）。
8. 将脊髓收集至含有5 mL HABG（表1）的15 mL离心管中，置于冰上。操作时注意避免挤压损伤脊髓。
9. 对同窝每只幼崽重复步骤1.1–1.8。
   注意：理想情况下，每根脊髓的处理时间应少于30分钟，以确保获得健康的神经元分离效果。

2. 分离神经元

注意：以下步骤应在超净工作台中进行。操作者应熟悉基本的无菌技术。

1. 组织切碎
   1. 取含有脊髓的离心管，轻轻振荡以悬浮组织。
   2. 将管中的组织倒入60 mm玻璃培养皿中，用刀片切碎，制成约0.5 mm大小的细小组织块。
   3. 用宽口移液管将组织转移至含有5 mL HABG的15 mL离心管中。
   4. 将离心管置于30 °C水浴中30分钟，使细胞在此温度下达到平衡。保持细胞在轻微振荡条件下，以确保其悬浮于液体中。
      注意：此步骤旨在避免细胞从冰上直接转移到消化液时受到温度冲击。将细胞维持在30 °C有助于降低因在37 °C时代谢增强而导致的细胞死亡。
2. 制备消化液（表1）。
3. 制备密度梯度（表1）。
   1. 按照 表1中所述，在4个独立的15 mL离心管中分别制备4层梯度液。
   2. 从每一层中各取1 mL，依次加入一个新的15 mL离心管中。从底部开始加入第1层，依次叠加至顶部的第4层。添加过程中避免扰动各层。
4. 清洗PDL包被的培养板。先用无菌水清洗数分钟，然后去除残留水分，并静置干燥1小时。
5. 将组织转移至消化液中。
   1. 从30 °C振荡水浴中取出含组织的离心管，静置数分钟使组织沉降。
   2. 从37 °C水浴中取出消化液管，用鲁尔锁接头注射器吸取消化液。
   3. 吸除含组织管中的过量HABG。
   4. 在注射器上安装鲁尔锁接头的0.2 μm滤器，将消化液加入含组织的离心管中。
   5. 将离心管置于30 °C水浴中30分钟。保持轻微振荡，使细胞悬浮于液体中。
      注意：必须避免细胞在消化液中停留过久或温度过高，否则可能导致过度消化，使组织悬浮于胶状混合物中。
6. 在此期间，包被层粘连蛋白（laminin）。
7. 进行吹打处理（即 将细胞从组织中分离）。
   1. 从30 °C振荡水浴中取出离心管，静置数分钟使组织沉降。
   2. 吸除多余的消化液。
   3. 用2 mL HABG重悬组织。
   4. 使用细口移液管，吹打10次，持续45秒。
      注意：这可能是最关键的一步，若操作不当会显著降低细胞得率。
      1. 将组织吸入移液管后立即全部排出。
      2. 避免引入空气，否则会显著降低活细胞得率。
         注意：理想的移液管为9英寸玻璃移液管。移液管尖端应经火焰抛光以消除粗糙表面，随后进行硅化处理：将移液管置于二氯二甲基硅烷（DMDCS）与氯仿按1:20配制的溶液中过夜。之后取出移液管，使其自然晾干，再进行高压灭菌以实现灭菌。
         注意：DMDCS和氯仿高度易燃，硅化过程必须在通风橱中进行。
   5. 吸出上层2 mL上清液，转移至新标记为“收集”的15 mL离心管中。
   6. 重复步骤2.7.3–2.7.5两次（最终细胞收集管中应有6 mL液体）。
   7. 缓慢将收集管中的内容物转移至在步骤2.2中制备好的梯度管中，注意避免破坏梯度结构。
8. 此时，从冰箱中取出先前配制的Neurobasal培养基（表1），放入37 °C水浴中预热。
9. 纯化神经元。
   1. 将梯度管在22 °C下以800 x g 离心15分钟。
   2. 用移液管收集目标层（图2），转移至新的15 mL离心管中。若需最高纯度的神经元分离（即 >90%），收集第3层；若追求更高得率而接受较低纯度（即 >70–80%），则收集第2层和第3层。
   3. 加入5 mL HABG以稀释密度梯度液。
   4. 在22 °C下以200 x g 离心2分钟。
   5. 弃去上清液，用5 mL HABG重悬沉淀，并轻弹管底以充分悬浮细胞。
   6. 在22 °C下以200 x g 离心2分钟。
   7. 弃去上清液，用3 mL Neurobasal培养基重悬细胞，并轻弹管底使细胞重新悬浮。

培养基	保存条件	成分			制备方法
HABG	4 °C/24小时		100 mL		- 将B27在4 °C冰箱中过夜解冻 - 过滤除菌（0.22 µm）
		Hibernate A	97.8 mL
		B27 [2%]	2 mL
		GlutaMAX [0.5 mM]	0.25 mL
Neurobasal 培养基	4 °C/1周		100 mL		- 将B27在4 °C冰箱中过夜解冻 - 过滤除菌（0.22 µm） - 分装为每管50 mL至50 mL离心管中（4 °C保存）
		Neurobasal A	97 mL
		B27 [2%]	2 mL
		GlutaMAX [0.5 mM]	0.25 mL
		Pen/Strep [1%]	1 mL
消化培养基	分离当天使用		10 mL		- 剧烈震荡混匀 - 置于37°C水浴中30分钟（建议在使用前30分钟配制） - 过滤除菌（0.22 µm）
		HA-Ca	10 mL
		Papain	25 mg
		GlutaMAX [0.5 mM]	0.025 mL
密度梯度液	分离当天使用		1个梯度
		层级	OptiPrep	HABG
			(0.13 mL)	(5.29 mL)
		1 底层	0.26 mL	1.24 mL
		2	0.19 mL	1.31 mL
		3	0.15 mL	1.35 mL
		4 顶层	0.11 mL	1.39 mL

表1：本实验方案中所用培养基与溶液的配制。

结果

图 1:3 天龄新生小鼠的脊柱解剖和脊髓释放。（a） 中的箭头指向脊柱的尾端，在那里插入针头以释放脊髓。释放的脊髓 （b） 浸没在 PBS 中。

图 2:离心后添加细胞的密度梯度。这些图层被勾勒出来，并在卡通描绘上更好地可视化。最浅层 （0） 通常是脊髓组织的碎片。第 1 层富含少突胶质细胞和星形胶质细胞。第 2 层和第 3 层包含大多数神经元。虽然第 3 层包含纯度最高的神经元，但在第 2 层中发现了一些支持细胞（即...

材料

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 本文使用的材料清单 姓名 公司 目录编号 评论 Hibernate A 培养基 - 500 mL 赛默飞世尔 A1247501 https://www.thermofisher.com/ order/catalog/product/A1247501 休眠 A 减钙 - 500 mL 脑咬 HA-钙 http://www.brainbitsllc.com/ hibernate-a-minus-calcium/ 谷氨酰胺 100X - 100 mL 赛默飞世尔 35050061 https://www.thermofisher.com/ order/catalog/product/35050079 B27 添加剂 50X - 10 mL 赛默飞世尔 17504044 https://www.thermofisher.com/ order/catalog/product/17504044 木瓜蛋白酶，冻干 - 100毫克 沃辛顿 LS003119 http://www.worthington- biochem.com/pap/cat.html Neurobasal A 培养基 - 500 mL 赛默飞世尔 10888022 https://www.thermofisher.com/ order/catalog/product/10888022 青霉素 - 链霉素 （10,000 U/mL） 赛默飞世尔 15140122 https://www.thermofisher.com/ order/catalog/product/15140122 聚-D-赖氨酸 （PDL） 氢溴酸盐 - 5 毫克 西格玛-奥德里奇 货号 P6407-5MG http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sigma/p6407？ lang=en®ion=US 小鼠层粘连蛋白 - 1 毫克 赛默飞世尔 23017015 https://www.thermofisher.com/ order/catalog/product/23017015 台盼蓝 - 20 mL 西格玛-奥德里奇 T8154-20毫升 http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sigma/t8154？ lang=en®ion=US OptiPrep 密度梯度培养基 - 250 mL 西格玛-奥德里奇 D1556-250 毫升 http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sigma/d1556？ lang=en®ion=US 二氯二甲基硅烷（DMDCS，Sigma Silicoat） 西格玛-奥德里奇 440272-100 毫升 http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/aldrich/440272？ lang=en®ion=US 氯仿 西格玛-奥德里奇 288306-1L http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sial/288306？ lang=en®ion=US 玻璃移液管 - 9" 西格玛-奥德里奇 13-678-20C http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sigma/cls7095d9？ lang=en®ion=US 移液器球 - 5 mL 西格玛-奥德里奇 Z186678-3EA http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/aldrich/z186678？ lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-
_-prodRecCold_xviews-_- 产品RecCold10-1 BRAND^® 培养皿，玻璃 - 60 x 15 mm 西格玛-奥德里奇 BR455717-10EA http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/aldrich/br455717？ lang=en®ion=US 无菌 24 孔细胞培养板 西格玛-奥德里奇 货号 M8812-100EA http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sigma/m8812？ lang=en®ion=US