脊髓神经元分离:分离新生儿脊髓神经元用于体外研究的密度梯度程序

摘要

[在此处插入FIGURE1]

图 1:3 天龄新生小鼠的脊柱解剖和脊髓释放。（a） 中的箭头指向脊柱的尾端，在那里插入针头以释放脊髓。释放的脊髓 （b） 浸没在 PBS 中。

[在此处插入FIGURE2]

图 2:离心后添加细胞的密度梯度。这些图层被勾勒出来，并在卡通描绘上更好地可视化。最浅层 （0） 通常是脊髓组织的碎片。第 1 层富含少突胶质细胞和星形胶质细胞。第 2 层和第 3 层包含大多数神经元。虽然第 3 层包含纯度最高的神经元，但在第 2 层中发现了一些支持细胞（即星形胶质细胞和少突胶质细胞）。底部的沉淀主要含有小胶质细胞。

摘要

来源:Eldeiry， M. et al. 新生小鼠脊髓神经元分离和培养 J. Vis. Exp. （2017）

在本视频中，我们描述了从新生小鼠中分离脊髓神经元以进行体外研究的分步方案。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 采集脊髓

注意:所有仪器都应进行高压灭菌（135 °C 和 30 psi，4 x 7 分钟循环）以保持无菌。

在
1. 含有异氟醚的腔室中对 1-3 日龄的 C57BL/6 小鼠幼崽实施安乐死。停止运动后等待 30 秒并捏住腿以确认没有反应。
2. 用剪刀将头部与身体分开，幼犬处于俯卧姿势。
3. 将后腿或尾巴和手臂稳定在手术台上，背侧面向用户。
4. 用弯曲的虹膜剪刀剪掉皮肤。
5. 从臀部上方的腰部区域切开脊髓，然后切开胸部的两侧，将其与身体分开。
   注意:这需要小心地从内脏器官中解剖脊髓，以避免对其他器官的意外损伤（图 1a）。
6. 在含有 5 mL 0.2 μm 过滤灭菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的 3 x 10 cm 培养皿中依次洗涤 10 秒，以去除多余的组织。
7. 将装有 5 mL 过滤消毒 PBS 的 22G 针头和注射器插入脊柱尾端并颅部冲洗，使脐带流出第四个培养皿（图 1b）。
8. 将脊髓收集在冰上装有 5 mL HABG（表 1）的 15 mL 管中。小心避免压碎脊髓。
9. 对窝中的每只幼崽重复步骤 1.1-1.8。
   注意:理想情况下，每个脊髓的此过程应少于 30 分钟，以确保健康的神经元隔离。

2. 隔离神经元

注意:以下步骤应在层流罩中执行。预计熟悉基本的无菌技术。

1. 纸巾切碎
   1. 取含有脊髓的管子，轻轻摇晃以悬浮组织。
   2. 将管中的组织倒入 60 mm 玻璃培养皿中，用剃须刀片切丁，制成 ~0.5 mm 大小的细块。
   3. 用大口径移液器将组织转移到含有 5 mL HABG 的 15 mL 管中。
   4. 将其置于 30 °C 水浴中 30 分钟，以使细胞在此温度下平衡。将细胞放在摇床上，使其悬浮在液体中。
      注意:执行此步骤是为了避免在从冰转移到消化培养基时电击细胞。将细胞保持在 30 °C 有助于减少与 37 °C 时新陈代谢增加相关的细胞死亡。
2. 准备消化培养基（表 1）。
3. 准备密度梯度（表 1）。
   将
   1. 4 层中的每一层准备在 4 个单独的 15 mL 试管中，如表 1 所示。
   2. 将每层的 1 mL 加入新的 15 mL 试管中。从底部的第 1 层开始，然后依次添加，直到到达顶部的第 4 层。添加时避免干扰图层。
4. 清洗 PDL 涂层板。用无菌水洗涤几分钟，然后去除任何残留的水并让它们干燥 1 小时。
5. 将组织转移到消化培养基中。
   1. 从 30 °C 的摇床水浴中取出含有组织的管，并使其沉淀几分钟。
   2. 从 37 °C 水浴中取出消化培养基管，并将其吸入 leur-lock 注射器中。
   3. 从含有组织的管中吸出多余的 HABG。
   4. 在注射器上使用 leur-lock 0.2 μm 过滤器，将消化培养基添加到含有组织的试管中。
   5. 将试管置于 30 °C 水浴中 30 分钟。保持细胞振荡，使其悬浮在液体中。
      注意:重要的是不要将细胞在消化介质中放置太长时间或让温度过高，这可能导致过度消化并导致组织悬浮在凝胶状混合物中。
6. 在此期间，涂覆层粘连蛋白。
7. 进行研磨（即 将细胞与组织分离）。
   1. 从摇动的 30 °C 水浴中取出试管，并使其静置几分钟。
   2. 吸出过量的消化培养基。
   将
   3. 组织悬浮在 2 mL HABG 中。
   4. 使用窄口径移液器，研磨 10 次 45 s.
      注意: 这可能是最关键的步骤，如果作不当，可能会显着降低产量。
      1. 将组织吸入移液器中，并立即将内容物排回。
      2. 避免引入空气，因为它会显著降低实际产量。
         注意:理想的移液器是 9 英寸玻璃移液器。移液器的尖端应进行火焰抛光，以抚平粗糙的表面。然后应将其置于二氯二甲基硅烷 （DMDCS） 的氯仿溶液中，以 1:20 的比例进行硅化，并留下 O/N。然后应取出移液器并风干。随后，应对其进行高压灭菌。
         谨慎: DMDCS 和氯仿高度易燃，应在通风橱中进行硅化。
   5. 吸出顶部 2 mL 的上清液，并将其放入标有"收集"的新 15 mL 试管中。
   6. 再重复步骤 2.7.3–2.7.5 两次（细胞收集管结束时应有 6 mL）。
   7. 将收集管内容物缓慢转移到步骤 2.2 中制备的梯度管中，避免梯度中断。
8. 此时，从冰箱中取出先前制备的 neurobasal 培养基（表 1），并在 37 °C 的浴中加热。
9. 净化神经元。
   1. 将梯度管在 800 x g 和 22 °C 下离心 15 分钟。
   2. 用移液管收集所需的层（图 2）并放入新的 15 mL 试管中。对于最高纯度的神经元分离（即 >90%），收集第 3 层。为了获得更高的产量和较低的纯度（即>70–80%），收集第2层和第3层。
   3. 通过向新收集的层中添加 5 mL HABG 来稀释密度梯度。
   4. 在 22 °C 下以 200 x g 离心 2 分钟。
   5. 弃去上清液，重悬于 5 mL HABG 中，轻弹沉淀以悬浮细胞。
   6. 在 22 °C 下以 200 x g 离心 2 分钟。
   7. 弃去上清液，重悬于 3 mL Neurobasal 培养基中，轻弹沉淀以重悬细胞。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 媒体 存储 成分 制备 HABG 4 °C/24h 100 毫升 - 在 4 °C 冰箱中解冻 B27 O/N
- 过滤灭菌 （0.22 μm） 休眠 A 97.8 毫升 B27 [2%] 2 毫升 谷胱甘肽 [0.5 mM] 0.25 毫升 Neurobasal 培养基 4 °C/1 周 100 毫升 - 在 4 °C 冰箱中解冻 B27 O/N
- 过滤灭菌 （0.22 μm）
- 将 50 mL 份量分装到 50 mL 试管中（在 4 °C 下储存） 神经基底 A 97 毫升 B27 [2%] 2 毫升 谷胱甘肽 [0.5 mM] 0.25 毫升 笔/链球菌 [1%] 1 毫升 消化培养基 隔离日 10 毫升 - 剧烈摇晃
- 在 37°C 浴中放置 30 分钟（最好在使用前 30 分钟准备好）
- 过滤灭菌 （0.22 μm） HA-钙 10 毫升 木瓜 蛋白酶 25 毫克 谷胱甘肽 [0.5 mM] 0.025 毫升 密度梯度 隔离日 1 渐变 层 OptiPrep 准备 HABG （0.13 毫升） （5.29 毫升） 1 底部 0.26 毫升 1.24 毫升 阿拉伯数字 0.19 毫升 1.31 毫升 3 0.15 毫升 1.35 毫升 4 顶部 0.11 毫升 1.39 毫升

表 1:本协议中使用的培养基和溶液的制备。

结果

图 1:3 天龄新生小鼠的脊柱解剖和脊髓释放。（a） 中的箭头指向脊柱的尾端，在那里插入针头以释放脊髓。释放的脊髓 （b） 浸没在 PBS 中。

图 2:离心后添加细胞的密度梯度。这些图层被勾勒出来，并在卡通描绘上更好地可视化。最浅层 （0） 通常是脊髓组织的碎片。第 1 层富含少突胶质细胞和星形胶质细胞。第 2 层和第 3 层包含大多数神经元。虽然第 3 层包含纯度最高的神经元，但在第 2 层中发现了一些支持细胞（即...

材料