脊髓神经元分离：一种用于体外研究的新生大鼠脊髓神经元密度梯度分离方法

摘要

[在此处插入FIGURE1]

图 1:3 天龄新生小鼠的脊柱解剖和脊髓释放。（a） 中的箭头指向脊柱的尾端，在那里插入针头以释放脊髓。释放的脊髓 （b） 浸没在 PBS 中。

[在此处插入FIGURE2]

图 2:离心后添加细胞的密度梯度。这些图层被勾勒出来，并在卡通描绘上更好地可视化。最浅层 （0） 通常是脊髓组织的碎片。第 1 层富含少突胶质细胞和星形胶质细胞。第 2 层和第 3 层包含大多数神经元。虽然第 3 层包含纯度最高的神经元，但在第 2 层中发现了一些支持细胞（即星形胶质细胞和少突胶质细胞）。底部的沉淀主要含有小胶质细胞。

摘要

来源：Eldeiry, M. 等。 新生小鼠脊髓神经元的分离与培养。J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，我们详细描述了一种从新生小鼠分离脊髓神经元用于体外研究的逐步实验方案。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 脊髓的采集

注意：所有器械均应进行高压灭菌（135 °C、30 psi，4 次循环，每次 7 分钟）以确保无菌。

1. 将1至3日龄的C57BL/6小鼠幼崽置于异氟烷麻醉舱中实施安乐死。在动物停止活动后等待30秒，并轻捏腿部以确认无反应。
2. 将小鼠俯卧固定，使用剪刀分离头部与躯体。
3. 将小鼠的后肢或尾部及前肢固定在操作台上，使背部朝向操作者。
4. 使用弯头虹膜剪剪除皮肤。
5. 从髋部上方的腰段开始切断脊髓，并沿胸腔两侧剪开，将脊柱部分与躯体分离。
   注意：此步骤需小心分离脊髓与内脏器官，以避免意外损伤其他组织（图1a）。
6. 将组织依次浸入三个盛有5 mL经0.2 μm滤膜过滤除菌的磷酸盐缓冲液（PBS）的10 cm培养皿中，每皿洗涤10秒，以去除多余组织。
7. 将装有5 mL过滤除菌PBS的22G针头和注射器插入脊柱尾端，向头侧冲洗，使脊髓冲出并落入第四个培养皿中（图1b）。
8. 将脊髓收集至含有5 mL HABG（

结果

图 1:3 天龄新生小鼠的脊柱解剖和脊髓释放。（a） 中的箭头指向脊柱的尾端，在那里插入针头以释放脊髓。释放的脊髓 （b） 浸没在 PBS 中。

图 2:离心后添加细胞的密度梯度。这些图层被勾勒出来，并在卡通描绘上更好地可视化。最浅层 （0） 通常是脊髓组织的碎片。第 1 层富含少突胶质细胞和星形胶质细胞。第 2 层和第 3 层包含大多数神经元。虽然第 3 层包含纯度最高的神经元，但在第 2 层中发现了一些支持细胞（即.......

材料

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 本文使用的材料清单 姓名 公司 目录编号 评论 Hibernate A 培养基 - 500 mL 赛默飞世尔 A1247501 https://www.thermofisher.com/ order/catalog/product/A1247501 休眠 A 减钙 - 500 mL 脑咬 HA-钙 http://www.brainbitsllc.com/ hibernate-a-minus-calcium/ 谷氨酰胺 100X - 100 mL 赛默飞世尔 35050061 https://www.thermofisher.com/ order/catalog/product/35050079 B27 添加剂 50X - 10 mL 赛默飞世尔 17504044 https://www.thermofisher.com/ order/catalog/product/17504044 木瓜蛋白酶，冻干 - 100毫克 沃辛顿 LS003119 http://www.worthington- biochem.com/pap/cat.html Neurobasal A 培养基 - 500 mL 赛默飞世尔 10888022 https://www.thermofisher.com/ order/catalog/product/10888022 青霉素 - 链霉素 （10,000 U/mL） 赛默飞世尔 15140122 https://www.thermofisher.com/ order/catalog/product/15140122 聚-D-赖氨酸 （PDL） 氢溴酸盐 - 5 毫克 西格玛-奥德里奇 货号 P6407-5MG http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sigma/p6407？ lang=en®ion=US 小鼠层粘连蛋白 - 1 毫克 赛默飞世尔 23017015 https://www.thermofisher.com/ order/catalog/product/23017015 台盼蓝 - 20 mL 西格玛-奥德里奇 T8154-20毫升 http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sigma/t8154？ lang=en®ion=US OptiPrep 密度梯度培养基 - 250 mL 西格玛-奥德里奇 D1556-250 毫升 http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sigma/d1556？ lang=en®ion=US 二氯二甲基硅烷（DMDCS，Sigma Silicoat） 西格玛-奥德里奇 440272-100 毫升 http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/aldrich/440272？ lang=en®ion=US 氯仿 西格玛-奥德里奇 288306-1L http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sial/288306？ lang=en®ion=US 玻璃移液管 - 9" 西格玛-奥德里奇 13-678-20C http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sigma/cls7095d9？ lang=en®ion=US 移液器球 - 5 mL 西格玛-奥德里奇 Z186678-3EA http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/aldrich/z186678？ lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-
_-prodRecCold_xviews-_- 产品RecCold10-1 BRAND^® 培养皿，玻璃 - 60 x 15 mm 西格玛-奥德里奇 BR455717-10EA http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/aldrich/br455717？ lang=en®ion=US 无菌 24 孔细胞培养板 西格玛-奥德里奇 货号 M8812-100EA http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sigma/m8812？ lang=en®ion=US