心肺复合物脱细胞:一种从小鼠模型中脱细胞心脏和肺的技术

Abstract

来源:Mayorca-Guiliani， A. E. et al.小鼠心肺复合物的脱细胞。J. Vis. Exp.（2021 年）

该视频演示了一种通过脉管系统进行去污剂顺行灌注来产生脱细胞的细胞外基质或 ECM 支架的方法。然后，结构 ECM 支架可用于分析与心肺疾病相关的 ECM 重塑。

Protocol

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 验尸显微外科手术

1. 使用 CO₂ 室对小鼠实施安乐死。
   1. 将小鼠放入 4 L 腔室中，开始填充 100% CO₂，从 0.2 L/min 开始，持续 2 分钟，增加直到 3 分钟后达到 0.8 L/min 的流量。小鼠应在前 2 分钟内失去知觉，然后呼吸应停止（通常约为 5 分钟， 但可以根据需要保持流量）。在进行下一步之前确认死亡。
2. 用理发器剃掉小鼠的胸部、腹部和背部，并用 70% 乙醇消毒。剃须大大减少了由于用于成像或生化分析的样品上存在毛发而导致的伪影数量。
3. 将鼠标固定在聚苯乙烯托盘上，伸展其前肢和后肢，以及头部和尾部。将其置于显微外科显微镜下。
4. 使用 Mayo 直式剪刀通过从下颌下区域延伸到下腹部的皮肤切口建立手术通路，并在皮下解剖以露出胸壁和腹膜。
5. 使用显微外科剪刀，沿胸壁两侧的第六肋间隙剪断胸大肌和胸小肌。
6. 使用直式剪刀，沿着前面的切口切开胸骨，然后沿胸骨长轴切割完成胸骨切开术，然后抬高并固定胸壁的两侧，露出心肺复合体。
7. 使用圆头微型镊子（或 Dumont 微型镊子），通过小心地将胸腺和周围的脂肪组织从附件中拉出来切除它们。这将揭示主要船只。
8. 使用烧灼器烧灼下降腔静脉，并使用直式剪刀剪断食道。
9. 使用锋利的微镊子，将头臂静脉和头臂、左颈总动脉和左锁骨下动脉与底层组织分开，以促进结扎和烧灼。
10. 使用微型持针器、锋利的微型镊子和 9-0 缝合线将缝合线放置在头臂动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉的出现上方。
11. 烧灼头臂静脉。
12. 沿中线分离下颌下唾液腺，露出颈部肌肉和气管。分开肌肉以露出环甲韧带。使用微型剪刀，通过切开韧带来打开一个入口。
13. 在气管中引入一根 27 G 导管，轻轻推动直到气管分支到支气管中（即，直到达到对导管的阻力，然后后退 3 毫米）。小心不要破坏支气管。使用 6-0 缝合线，在气管周围缝 3 针以固定导管。
14. 在第 12 胸椎的高度切分鼠标。降主动脉位于脊柱前方，应与脊柱一起在此处切片。将下半部分分开。
15. 逆行导管插入主动脉并推动导管，直到它到达主动脉弧。使用 9-0 缝合线，在主动脉周围缝 4 针，从导管尖端下方 5 毫米开始。

2. 脱细胞

1. 使用硅胶管和 Luer 连接器将鼠标连接到泵系统。用 200 μL/min 的去离子水灌注 15 分钟。在脱细胞过程中保持此流速。
2. 将灌注剂改为用去离子水稀释的 0.5% 脱氧胆酸钠 （DOC） 并灌注过夜。
3. 将灌注剂改为用去离子水稀释的 0.1% 十二烷基硫酸钠 （SDS） 并灌注 8 小时。
4. 用去离子水灌注过夜以洗去 SDS 和 DOC 24 小时。
5. 通过使用弯曲剪刀将其附着物切开到胸部，切除脱细胞的心脏和肺，并在 4 °C 下用 1% （v/v） 青霉素 - 链霉素和 0.3 μM 叠氮化钠的去离子水储存在无菌冷冻管中。ECM 支架可以储存至少 12 周。如果支架将用于生化分析（例如质谱分析），请在液氮中快速冷冻。

Materials