心肺复合体脱细胞：一种用于小鼠模型心脏和肺脏脱细胞的技术

摘要

来源：Mayorca-Guiliani, A. E. 等. 小鼠心肺复合体的脱细胞化. J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了一种通过血管系统顺行灌注去污剂来制备脱细胞化细胞外基质（ECM）支架的方法。这些结构化的ECM支架随后可用于分析与心肺疾病相关的ECM重塑过程。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 尸检显微外科手术

1. 使用 CO₂ 腔室
   1. 将小鼠放入一个4 L的密闭室中，并开始 填充100% CO₂，从 0.2 L/min 开始，持续 2 分钟， 逐渐增加，3分钟后达到0.8 L/min的流速。 小鼠应在前2分钟内失去意识，随后呼吸 应停止（通常约5分钟，但可根据需要维持灌注）。在进行下一步操作前，须确认动物死亡。
2. 用毛发剪刀剃除小鼠的胸部、腹部和背部毛发，并用70%乙醇消毒。剃毛可显著减少因毛发残留在成像或生化分析样本上而产生的伪影。
3. 将小鼠固定于聚苯乙烯托盘上，伸展其前肢和后肢以及头部与尾部，置于显微外科显微镜下。
4. 使用梅奥直剪，从下颌下区至下腹部做皮肤切口，建立手术通路，并在皮下分离，暴露胸壁和腹膜。
5. 使用显微外科剪刀，沿胸壁两侧的第六肋间隙剪开胸大肌和胸小肌。
6. 使用直刃剪刀沿先前的切口剪开胸骨，然后沿胸骨长轴继续剪切以完成胸骨切开术，随后抬起并固定胸壁两侧，以暴露心肺复合体。
7. 使用圆头显微镊（或Dumont显微镊），轻柔牵拉胸腺及其周围脂肪组织，将其从附着处剥离。这将暴露出主要血管。
8. 使用电灼器灼闭下腔静脉，并用直型剪刀剪断食管。
9. 使用锋利的显微镊子，将头臂静脉以及头臂动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉与其下方组织分离，以便进行结扎和电灼。
10. 使用显微持针器、锐利的显微镊子和9-0缝线，在无名动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉的起始处上方缝合固定。
11. 电凝止血头臂静脉。
12. 沿中线分离下颌下唾液腺，暴露颈部肌肉和气管。分离肌肉以暴露环甲膜。使用显微剪刀剪开环甲膜，建立入口。
13. 将27 G导管插入气管，并轻柔推进，直至气管分叉至支气管处（即遇到阻力后回撤3 mm）。注意避免损伤支气管。使用6-0缝线，在气管周围缝合3针以固定导管。
14. 在第12胸椎水平处横断小鼠。降主动脉位于脊柱腹侧，应在此处连同脊柱一并切断。将下半部分分离放置。
15. 逆向插管至主动脉，并推进导管直至其到达主动脉弓。使用9-0缝线，在导管尖端下方5 mm处开始，于主动脉周围缝合4针。

2. 脱细胞化

1. 使用硅胶管和鲁尔接头将小鼠连接至灌注泵系统。以200 µL/min的流速用去离子水灌注15分钟。在脱细胞过程中保持此流速。
2. 将灌注液更换为0.5%脱氧胆酸钠（DOC）去离子水溶液，持续灌注过夜。
3. 将灌注液更换为0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）去离子水溶液，灌注8小时。
4. 用去离子水持续灌注过夜，以彻底洗去SDS和DOC，共24小时。
5. 使用弯头剪刀切断脱细胞心脏和肺与胸腔的连接组织，将其切除，并置于含有去离子水、1%（v/v）青霉素-链霉素和0.3 µM叠氮化钠的无菌冻存管中，于4 °C保存。细胞外基质（ECM）支架至少可保存12周。若支架将用于生化分析（如质谱分析），则需在液氮中速冻。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微外科
6-0 缝线，三角形截面针（Vicryl）	Ethicon	6301124
9-0 微型缝线（Safil）	B Braun	G1048611
Adson 镊子	Fine Science Tools	11006-12
带齿 Adson 镊子	Fine Science Tools	11027-12
Castroviejo 微型持针器	Fine Science Tools	12061-01
用于小鼠安乐死的 CO2 通风室
去离子水（Milli-Q IQ 7000，超纯水系统）	Merck	ZIQ7000T0
一次性聚苯乙烯托盘（约 30 × 50 cm）
解剖显微镜（Greenough 型，带双臂鹅颈管）	Leica	S6 D
双头微型刮匙	Fine Science Tools	10091-12
Dumont 微型镊子（两个）	Fine Science Tools	11252-20
尖端呈 45° 的 Dumont 微型镊子	Fine Science Tools	11251-35
毛发剪刀	Oster	76998-320-051
Halsey 持针器（带碳化钨钳口）	Fine Science Tools	12500-12
静脉用 24 号导管（Insyte）	BD	381512
静脉用 26 号导管（Terumo）	Surflo-W	SR+DM2619WX
Mayo 剪刀（强力剪，直型）	Fine Science Tools	14110-15
尖端带环的微型镊子	Aesculap	FM571R
微型弹簧剪刀（Vannas，弯型）	Fine Science Tools	15001-08
针头（27 号；Microlance）	BD	21018
纸巾（无菌）或手术巾
锯齿剪刀（CeramaCut，直型）	Fine Science Tools	14958-09
刮匙（Freer-Yasargil）	Aesculap	OL166R
注射器（1 mL；Plastipak）	BD	3021001
注射器（10 mL；Plastipak）	BD	3021110
肌腱剪刀（Walton）	Fine Science Tools	14077-09
脱细胞处理
70% 乙醇（纯度 99.9% 的无水乙醇）；必须使用去离子水将无水乙醇稀释至 70%（体积比）	Plum	1680766
去离子水（Milli-Q IQ 7000，超纯水系统）	Merck	ZIQ7000T0
鲁尔接头转管接头（公头，1/8 英寸）	World Precision Instruments	13158-100
鲁尔接头转管接头（公头，1/8 英寸）	World Precision Instruments	13158-100
PBS（pH 7.4，10×，Gibco）	Thermo Fisher Scientific	70011044
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
蠕动泵（12 通道）	Ole Dich	110AC(R)20G75
硅胶管（内径 2 mm，外径 4 mm）	Ole Dich	31399
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	08591-1ML-F
脱氧胆酸钠（DOC）	Sigma-Aldrich	D6750-100G