从小鼠模型中分离轮廓乳头（CVP）上皮：一种分离小鼠舌部CVP上皮的酶解法

摘要

来源：Shechtman, L. A. 等. 由成年小鼠味觉干细胞衍生的舌类器官的生成与培养. J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们介绍了从小鼠舌头上分离轮廓乳头（CVP）上皮的方法。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. CVP 上皮的分离

1. 根据IACUC规定，使用CO₂窒息法对小鼠实施安乐死，随后采用经批准的辅助方法，如双侧开胸、颈椎脱位、断头或放血法。
2. 使用大型无菌解剖剪剪开面颊并折断下颌骨。抬起舌头，剪断舌系带，使舌头与口腔底部分离。取出舌头并置于含有Ca²⁺和Mg²⁺的无菌冰冻杜氏磷酸盐缓冲液（dPBS）中保存。
3. 用刀片在磨牙间隆起前方稍作切割，移除并丢弃舌前部（图1A，虚线所示）。使用精细擦拭纸轻轻去除舌后部的毛发及多余液体。
4. 用1 mL注射器吸取200–300 µL消化酶溶液（终浓度：2 mg/mL I型胶原酶和5 mg/mL Dispase II，溶于含Ca²⁺/Mg²⁺的dPBS中，由10 mg/mL储存液稀释而成），将30 G × 1/2针头插入磨牙间隆起稍上方位置（图1B，黑色箭头所示），直至轮廓乳头（CVP）前方稍近处（图1B，黑色框所示）。将酶溶液注射至CVP上皮与下方组织（固有层、肌肉）之间的侧缘下方。注射过程中缓慢且持续地从舌体中退出注射器。
5. 将舌头置于无菌、不含Ca²⁺/Mg²⁺的dPBS中，在室温下精确孵育33分钟。
6. 使用超细解剖剪在CVP前方双侧上皮处做小切口，用精细镊子轻轻提起并剥离上皮。一旦沟槽上皮与下方结缔组织完全分离，将其转移至预先用FBS包被的空2 mL微量离心管中。可在分离CVP上皮之前或之后进行上皮修剪（图1C, D）。

结果

图1：解剖后的舌头及剥离的轮廓乳头（CVP）上皮。（A）将舌头完整解剖取出，并在磨牙间隆起前方（虚线处）进行切割，去除舌前部，保留包含轮廓乳头（CVP）的舌后部（黑框所示）。（B）在磨牙间隆起稍前方插入针头（黑箭头），将酶混合液注射至CVP下方及其侧缘（黑框区域）。（C）未修剪的剥离上皮，围绕CVP沟槽分布（黑箭头）；（D）经修剪后的剥离CVP上皮。成功剥离沟槽后，可观察到冯·埃布纳腺体及其导管（D，黑箭头）。比例尺：1 mm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL TB 注射器	BD 注射器	309659
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（含 Ca²? & Mg²?）	Gibco	10010-023
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（含 Ca²? & Mg²?）	Sigma Life Sciences	D8662-500ML
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11252-30
胎牛血清（FBS）	Gibco	26140-079
1 mL TB 注射器 	BD 注射器	309659
2.0 mL 微量离心管 	USA Scientific 	1420-2700
手术剪刀 - 锐利型	Fine Science Tools	14002-14
超精细 Bonn 剪刀 	Fine Science Tools 	14084-08
大数字计时器/秒表	Fisher Scientific	S407992
体视显微镜	Zeiss	Stemi SV6
Cohan-Vannas 弹簧剪刀	Fine Science Tools	15000-02
胶原酶 I 型（源自溶组织梭菌）	Sigma Life Science	C0130-1G
Dispase II（中性蛋白酶，II 级）	Sigma-Aldrich (Roche)	4942078001