将微气泡注射到离体小鼠胚胎中:一种将微泡造影剂输送到活小鼠胚胎的脉管系统的技术

摘要

来源:Denbeigh， J. M. et al.对比成像。J. Vis. Exp.（2015 年）

该视频演示了将微泡造影剂注射到分离的妊娠晚期小鼠胚胎中的程序。基于微泡造影剂的超声成像有助于可视化和表征胚胎的血管环境。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 微气泡制备

1. 制备注射用微气泡
   注意:当"将微气泡 （MB） 注射到胚胎中"开始时，助手执行此步骤。每个胚胎注射一次，助手随机选择每次注射选择的微泡类型，以便所有类型的微泡在整个过程中均匀分布，但以随机顺序给出。确保外科医生对注射的气泡类型视而不见。
   1. 确定在 400 μL 体积中产生 1 x 10⁸ MB/mL 终浓度所需的气泡储备液体积（使用储备液浓度计算体积）。将相应体积的盐水分装到空的微量离心管中。
   2. 轻轻搅拌选定的微泡样品瓶，并使用 21 G 针头将过量体积（比上述计算值大 ~50 μL）吸入 1 mL 注射器中。将微泡注入空的微量离心管中。
   3. 吸取所需体积的微泡原液，并加入等分试样的盐水中。用移液器尖端轻轻搅拌混合。
   4. 使用 21 G 针头将稀释的微泡溶液吸入干净的注射器中。取下针头，消除注射器中的任何气泡，然后连接鲁尔接头和管路。慢慢将溶液推至管路末端，确保不产生任何气泡。
   5. 将注射器插入注射器输液泵组中，以 20 μL/min 的速率分配微泡，总体积为 20 μL。将拉出的玻璃针连接到管子的末端。将泵移到靠近注射阶段的位置。

2. 将微气泡注射到胚胎中

1. 从冷藏的培养基培养皿中随机选择并取出（用多孔勺子）一个胚胎。放入位于立体镜下方超声台上的解剖皿中，用细镊子去除卵黄囊和羊膜，从血管化程度最低的一侧（不定时侧）切割/撕裂。这可以通过刺穿与头部区域相邻的区域来最容易实现。
   1. 切得足够多，以便从内部取出胚胎，但不能再多了。使用小块橡皮泥稳定解剖皿。
2. 从胚胎周围轻轻地移动囊。将胚胎侧卧，胎盘和脐血管在前面。根据需要，使用昆虫针固定卵黄囊（推荐 4 针）和胎盘边缘，以固定到位。避开大型船只。
3. 用预热的 45°C PBS 洗涤胚胎，直到胚胎恢复。识别脐静脉及其相关的血管网络。调整培养皿的位置，以便可以舒适地进行注射。
   注意:一旦加热，胚胎中的血液将开始流动，明显地泵入脐动脉。当血流第一次开始时，静脉会呈鲜红色，两条血管中的血液很快就会看起来相同。从脐静脉产生的分支通常覆盖在胎盘表面的脐动脉分支。
4. 胚胎恢复后，用预热的美国凝胶覆盖它（但不是胎盘），确保小心地去除胚胎周围的任何气泡（使用细镊子）。在盘子里加满预热的 PBS。
   注意:密切关注 PBS 和凝胶注射器中的溶液液位，并根据需要将备用注射器添加到加热杯中。
5. 将玻璃针安装在解剖皿边缘的大橡皮泥球上，然后将针端插入 PBS。在胎盘的绒毛膜表面选择一条静脉，尽可能远离主支，用剪刀将尖端修剪成合适的尺寸。如果尖端以小角度切割，则注射最容易。使用弹簧剪刀的边缘去除玻璃杯的任何锯齿状边缘。
6. 使用注射泵，以 20 μL/min 的速度将微泡溶液缓慢注入玻璃针头中，直到所有空气从针头尖端排出，可以看到微气泡自由流入 PBS。停止泵并重置，进样体积为 20 μL。注射过程中不要让空气进入胚胎的血管系统。
7. 将玻璃针尖轻轻插入胎盘中的一条静脉中，并确保其不动。摆动立体镜头，将换能器置于胚胎上方。启动成像。

材料