向分离的小鼠胚胎注射微泡：一种将微泡造影剂递送至活体小鼠胚胎血管系统的技术

摘要

来源：Denbeigh, J. M. 等。利用高频超声对小鼠胚胎进行对比成像。J. Vis. Exp. (2015)

本视频演示了将微泡造影剂注入离体晚期妊娠阶段小鼠胚胎的操作流程。基于微泡造影剂的超声成像有助于可视化并表征胚胎的血管环境。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 微泡制备

1. 准备用于注射的微泡
   注意： 当开始“向胚胎注射微泡（MB）”时，由助手执行此步骤。每个胚胎仅注射一次，每次注射所使用的微泡类型由助手随机选择，以确保所有类型的微泡在整个操作过程中均匀分布，但注射顺序随机。确保外科医生对所注射的微泡类型处于盲态。
   1. 根据所需终浓度为 1 × 10⁸ MB/mL 和总体积为 400 µL 的条件，计算所需原液微泡溶液的体积（根据原液浓度进行计算）。将相应体积的生理盐水加入一个空的微量离心管中。
   2. 轻轻振荡选定的微泡小瓶，使用 21 G 针头将略多于上述计算体积（约多出 50 µL）的溶液吸入 1 mL 注射器中。将微泡注入一个空的微量离心管中。
   3. 用移液器吸取所需体积的微泡原液，并加入已分装的生理盐水中。用移液器吸头轻轻搅拌混合。
   4. 使用 21 G 针头将稀释后的微泡溶液吸入一支洁净的注射器中。取下针头，排除注射器中的任何气泡，然后连接鲁尔接头和管路。缓慢推动溶液至管路末端，确保不产生气泡。
   5. 将注射器插入注射泵中，并设定参数为以 20 µL/min 的速率注入，总注射体积为 20 µL。在管路末端连接一根拉制的玻璃针头。将泵移至靠近注射台的位置。

2. 向胚胎注射微泡

1. 从冷藏的培养皿中随机选取一个胚胎，并用带孔的勺子将其取出。将其置于体视显微镜下超声平台上的解剖皿中，用精细镊子去除卵黄囊和羊膜，从血管分布较少的一侧（反胚座侧）进行剪切或撕开。最简便的操作方式是在靠近头部区域的邻近部位穿刺。
   1. 剪切范围以足以将胚胎取出为宜，但不要过度。使用少量橡皮泥固定解剖皿，防止移动。
2. 轻柔地将囊膜从胚胎周围分离。将胚胎侧置，使胎盘和脐带血管位于前方。根据需要，使用昆虫针将卵黄囊（建议使用4根针）及胎盘边缘固定于皿底，注意避开主要血管。
3. 用预热至45°C的PBS清洗胚胎，直至胚胎恢复活动。辨认脐静脉及其相关的血管网络。调整解剖皿位置，以便于进行注射操作。
   注意： 胚胎升温后，其体内血液开始流动，可在脐动脉中观察到明显的搏动性血流。血流初始时，静脉呈鲜红色，随后两血管内的血液颜色迅速趋于一致。在胎盘表面，源自脐静脉的分支通常覆盖于脐动脉分支之上。
4. 胚胎复苏后，用预热的超声耦合剂覆盖胚胎（避免覆盖胎盘），并使用精细镊子小心清除胚胎周围的气泡。向解剖皿中补充预热的PBS。
   注意： 注意观察PBS和耦合剂注射器中的液体余量，必要时将备用注射器放入加热烧杯中预热。
5. 将玻璃针固定在解剖皿边缘的一团较大橡皮泥上，并将针尖插入PBS中。选择胎盘盘状结构绒毛膜面上距离主干分支尽可能远的静脉，用剪刀将针尖修剪至合适长度。若将针尖剪成轻微斜面，则更便于注射。使用弹簧剪刀的边缘去除玻璃针尖的毛刺。
6. 使用注射泵以20 µL/min的速度缓慢将微泡溶液注入玻璃针中，直至针尖内的空气完全排出，且可见微泡在PBS中自由流动。停止泵注，并将注射体积重新设定为20 µL。注射过程中严禁空气进入胚胎的血管系统。
7. 将玻璃针尖轻柔插入胎盘中的某一支静脉，并确保其固定不动。移开体视显微镜镜头，将超声探头置于胚胎上方，开始成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
冰
0.9% 氯化钠（生理盐水）	Hospira	0409-7984-11
磷酸盐缓冲液 [1x]	Sigma	D8537	1×，不含氯化钙 & 氯化镁
超声造影剂，靶向与非靶向	MicroMarker；VisualSonics 公司
超声耦合剂（Aquasonic 100，无色）	CSP Medical	133-1009
冰桶	Cole Parmer	RK 06274-01
成像平台	VisualSonics 公司	集成导轨系统
光源，光纤	Fisher Scientific	12-562-36	理想情况下应具有可调节的臂架
卢尔斯（12），聚丙烯带倒钩雌性接头 ¼-28 UNF 螺纹	Cole Parmer	45500-30
微型超声系统，高频	VisualSonics 公司	Vevo2100
21号针头  (1”)	VWR	305165
穿孔勺（Moria）	精细科学工具	MC 17 10373-17
大头针（6个），黑色阳极氧化微型钉，直径0.15 mm	精细科学工具	26002-15
1 mL Normject 注射器	Fisher	14-817-25
注射泵	Bio-lynx	NE-1000
移液器 [2-20 μL，20-200 μL，100-1,000 μL]	Eppendorf	研究增强型可调 3120000038; 3120000054; 3120000062
移液器吸头 [2-200 μL，50-1,000 μL]	Eppendorf	epT.I.P.S. 22491334; 022491351
剪刀
玻璃毛细管，1 x 90 mm GD-1 带尼龙丝	Narishige	GD-1
玻璃针拉制仪	Narishige	PN-30
Eppendorf 管	VWR	20170-577
试管架（3）	VWR	82024-462
加热板	VWR	89090-994
注射器（10个），30 mL	VWR	CA64000-041
超声换能器，20 MHz	VisualSonics 公司	MS250