基于拭子的结膜共生细菌分离技术：一种从小鼠模型结膜中分离共生细菌的方法

摘要

来源：Smith-Page, K. 等。小鼠结膜共生菌的分离与鉴定。J. Vis. Exp. (2021)

本视频介绍了一种基于拭子的技术，用于从眼结膜中分离可存活的共生细菌。该技术可用于分析结膜共生细菌微生物组，这些微生物组在抵御病原体方面发挥着防御作用。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 眼部拭子制备、操作区域设置、小鼠眼部拭子采集及样本富集

1. 准备无菌眼拭子
   注意：无菌眼拭子为自制，由薄层脱脂棉包裹的细木签制成。
   1. 根据需采样的小鼠数量，将适量脱脂棉和木签放入高压灭菌器中灭菌。
   2. 用拇指和食指夹取约半厘米长的脱脂棉条，再用双手拇指和食指轻轻拉扯棉条边缘，使其展开成一层扁平、多孔的单层结构，注意避免完全撕裂（拉伸过程中有少量棉絮散落是可接受的）。
   3. 将展开的脱脂棉轻轻缠绕在木签尖端，一手握住棉条末端并随木签旋转捻动，见图1。最终制成的眼拭子应在尖端覆盖一层极薄的棉层，向外延伸约0.5至1厘米。
   4. 将“完成”的拭子以棉端朝下插入小烧杯中，盖上盖子后进行高压灭菌。
2. 设置工作区
   1. 在无菌50 mL离心管中配制麻醉剂：加入2 mL氯胺酮（100 mg/mL）、400 µL赛拉嗪（100 mg/mL）和27.6 mL无菌生理盐水（0.9% NaCl in dH₂O）。经滤器除菌后分装，供立即使用（可于4 °C保存1个月；使用前须恢复至室温）。
   2. 用消毒剂清洁工作区域，以减少污染风险。
   3. 将0.5 mL无菌脑心浸出液培养基（BHI）分装至已标记的1.5 mL无菌微量离心管中（每只小鼠及对照各一管），置于冰上的微量离心管架中。
   4. 按以下顺序布置工作流程（从左至右）：小鼠麻醉区（实验小鼠笼、空的无菌笼、室温麻醉剂、25 G针头和1 mL注射器）、眼拭子采样区（冰上放置的分装BHI、灭菌眼拭子、洁净纸巾、70%异丙醇喷雾）和接种区（室温5%羊血Trypticase大豆琼脂平板、10 µL移液器、10 µL无菌一次性吸头、生物危害废物容器）。
3. 眼拭子采样
   1. 按每克体重10 µL剂量，分别给予成年小鼠腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪混合麻醉剂，并将小鼠放入已灭菌的笼中。通过捏压后肢足垫检测麻醉效果；无反应表示麻醉充分。
   2. 指定一只手仅用于处理麻醉后小鼠，另一只手仅用于操作眼拭子和培养管。采样时，取出完全麻醉的小鼠，侧卧于洁净操作台面，使左眼暴露。用异丙醇喷洒戴手套的手，并用洁净纸巾擦干。
   3. 用专用于处理培养基的手打开对应标记的BHI微量离心管，随后将管放回冰上的离心管架。将眼拭子的棉头浸入BHI培养基中，取出时在管内壁轻轻旋转2次，以去除多余液体。
   4. 用处理小鼠的手轻轻抓住小鼠颈背部皮肤固定。另一只手将眼拭子棉头轻抵左眼内侧结膜部位，见图2A。轻压眼球，并在下眼睑与眼球之间以“擦窗”方式来回移动拭子10次（图2B），保持均匀压力。
   5. 避免接触毛发，垂直取出拭子，直接将棉头朝下放入标记好的含BHI培养基的微量离心管中。在采样眼滴入润滑性眼药水。
   6. 将小鼠放回笼中。
   7. 让拭子在冰上静置10至15分钟，随后用已灭菌的手套手持手套轻柔混匀管内液体10次。取出拭子时，在微量离心管内壁旋转5次，以充分释放微生物。将拭子丢弃至生物危害废物容器中。
   8. 对每只小鼠及对照样本（皮肤或毛发拭子）重复步骤1.3.2至1.3.7。每次采样之间应对手套进行适当灭菌处理。
4. 增菌培养
   1. 将样本在37 °C静置培养1小时以进行增菌。
   2. 培养期间，为每只小鼠准备一个室温的含5%羊血的Trypticase大豆琼脂平板（TSA平板），并将平板均分为两半。
   3. 眼拭子培养结束后，从培养箱中取出增菌样本，置于冰上。
   4. 短暂涡旋混匀样本，然后按照图3A所示示意图进行接种。取10 µL样本滴加于TSA平板一侧，倾斜平板形成条带，重复2次。
   5. 在平板分界线另一侧，将10 µL样本以点状方式接种于琼脂表面，共点9次。
   6. 将平板在37 °C培养18小时、2天和4天（置于洁净环境中，防止琼脂干燥）。计数条带中的菌落，记录形态特征，并计算每拭子的菌落形成单位（CFUs），针对形态相似的分离株进行统计。通过点样区域观察是否出现条带中未捕获的独特微生物。

结果

图 1：自制眼拭子。
(A) 将一小段约 1 cm 长的拉伸棉絮夹在无菌牙签尖端与食指之间，然后在保持对食指轻微压力的同时旋转牙签，直至棉絮完全缠绕在牙签尖端上。(B) 眼拭子示例。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1 至 10 μl 移液器吸头 	USA Scientific 	1110-300 	使用前高压灭菌
0.5 至 10 μl Eppendorf 移液器 	Fisher Scientific 	13-690-026
1 ml 注射器 	Fisher Scientific 	BD309623 	每组眼拭子使用一支注射器
1.5 ml Eppendorf 离心管 	USA Scientific 	1615-5500 	使用前高压灭菌
1000 μl 移液器吸头 	USA Scientific 	1111-2021 	使用前高压灭菌
200 至 1000 μl Gilson 移液器（P1000）	Fisher Scientific 	F123602G
25 G 针头 	Fisher Scientific 	14-826AA 	每组眼拭子使用一根针头
3 % 过氧化氢 	Fisher Scientific 	S25359
37 ° C 培养箱 	实验设备
70 % 异丙醇	Fisher Scientific 	PX1840-4
Ana-Sed 注射液（赛拉嗪 100 mg/ml）	Santa Cruz Animal Health 	SC-362949Rx
本生灯 	实验设备
洁净纸巾 	实验设备
棉絮/无菌卷棉 	CVS
氯胺酮（100 mg/ml） 	Henry Schein	9950001
小鼠 	Jackson Labs	C57/BL6J
培养皿 	Fisher Scientific 	08-757-12 	用于甘露醇盐琼脂平板
RPI 脑心浸出液培养基 	Fisher Scientific 	50-488525 	按说明配制并进行高压灭菌
SteriFlip（0.22 μm 孔径聚酯砜滤膜）	EMD/Millipore, Fisher Scientific	SCGP00525 	用于麻醉剂的除菌
无菌小鼠笼	实验设备
牙签（圆形竹制） 	Kitchen Essentials 		使用前高压灭菌，并在制备拭子前进行擦拭消毒
胰蛋白胨大豆琼脂 II 加 5% 羊血平板	Fisher Scientific 	4321261	使用前于 4 °C 保存
一次性眼药水 	CVS Pharmacy 		Bausch and Lomb Soothe 润滑眼药水，28 支，每支 0.02 fl oz