基于成像夹具支撑的小鼠肝脏分期成像用于多光子显微血管可视化：一种借助稳定装置获取小鼠肝脏血管多维图像的成像技术

摘要

来源：Rongrong, W. 等. 小鼠肝组织血管的多光子显微观察. J. Vis. Exp. (2021)

本视频介绍了一种成像方法，用于在稳定小鼠肝脏器官后，利用多光子显微镜观察和研究其血管内的动态过程。多光子显微镜能够在活体条件下以高空间分辨率对生物组织进行成像。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 小鼠准备

1. 麻醉小鼠
   1. 用注射器准备戊巴比妥钠（50 mg/kg）。
   2. 用左手抓取小鼠（8周龄雄性C57BL/6），使其腹部朝上，头部低于尾部。用75%酒精对腹部皮肤进行消毒。
   3. 右手持注射器，将针头从腹白线稍偏右侧3–5 mm处刺入皮肤，针头与皮肤呈45°角，缓慢将戊巴比妥钠注入腹腔。剃毛后，用75%酒精和氯己定溶液交替擦拭小鼠手术部位周围，共消毒3次。
   4. 通过观察小鼠是否丧失翻正反射来判断麻醉是否成功。
2. 经尾静脉注射异硫氰酸罗丹明B-葡聚糖。
   1. 用注射器准备100 µL浓度为10 mg/mL的异硫氰酸罗丹明B-葡聚糖溶液。
   2. 用75%酒精擦拭小鼠尾巴。
   3. 左手握住尾巴，右手持注射器，使针头平行于静脉方向，注入100 µL染料。
   4. 注射后用棉签压迫止血。
3. 用无菌水浸湿的纱布浸湿小鼠腹部毛发，然后使用剃刀沿毛发生长方向剃除腹部毛发。剃毛后，用75%酒精和氯己定溶液交替擦拭小鼠手术部位周围，共消毒3次。
4. 用75%酒精擦拭加热垫后，打开加热垫电源，将小鼠仰卧放置于加热垫上，维持其体温在37 °C。

2. 使用身体器官成像支架固定小鼠肝脏

注意： 商用器官成像支架尚未发布。

1. 将一个干净的吸盘固定在指定位置。
2. 安装器官成像固定装置（图1），并用75%酒精擦拭加热垫和吸盘。
3. 将吸盘（直径5 mm）连接至真空泵管路，并开启真空泵。
4. 在经75%酒精消毒的无菌操作台上，交替使用75%酒精和氯己定溶液对小鼠切口周围区域进行三次消毒，然后再次交替使用75%酒精和氯己定溶液对小鼠切口周围区域进行三次消毒，随后使用手术剪从小鼠胸骨下缘向下剪去2 cm皮肤，暴露肝脏。
5. 将小鼠连同加热垫一起放置于支架底座上。
6. 调节器官成像固定装置，使吸盘固定住肝脏，然后施加30–35 kPa的负压进行吸附，使肝脏牢固贴附于吸盘上（图2）。

3. 调整多光子激光扫描显微镜

1. 打开多光子显微镜，并选择 60x/1.00 W 物镜。
2. 将固定架和小鼠置于物镜下方并固定。
3. 滴加一滴生理盐水，使其覆盖整个透镜（即负压吸引杯的中心），并调节物镜至刚好接触生理盐水。
4. 双击计算机图标以启动激光软件并打开开关，然后按住电源按钮和快门 3 秒。
5. 将波长设置为 800 nm。
6. 使用计算机启动显微镜操作软件。
7. 在 采集设置 中，选择 激光 800。

结果

图1：活体器官成像支架装置。（a）加热垫：用于维持小鼠体温。（b）支架：可为小鼠提供放置平台，并通过旋钮调节吸盘的位置。（c）吸盘：由支架固定。负压泵提供的负压使肝脏吸附于吸盘中央的透明镜片上。（d）软管：连接吸盘与压力泵。压力泵通过软管向吸盘提供负压。（e）离心管：位于软管中间，可用于收集液体，防止液体被吸入真空泵中。（f）负压泵：通过软管与吸盘相连，可为吸盘提供负压，使肝脏紧贴镜片。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器 × 2 	Hunan Pinan Medical Devices Technology 	YA0551
5 W 加热垫	BiolinkOptics Technology	BL336
75% 绝对乙醇	广东光华科技股份	1.17113.023
吸水棉球	Healthy Sanitation Kingdom
小鼠手术器械	RWD 生命科学	SP0001-G	包括剪刀和镊子
多光子显微镜	Olympus	FV1200MPE
器官成像固定装置	BiolinkOptics Technology	BL336	包括吸盘、软管、负压泵和支架
罗丹明B异硫氰酸-葡聚糖	Sigma	R9379
戊巴比妥钠 	Sigma 	P3761-25G
剃毛机	雷瓦	RE-3201