小鼠瓣膜间质细胞的分离：一种从鼠主动脉瓣分离和培养VIC的酶消化法

摘要

来源：Bouchareb, R. 等。分离小鼠主动脉瓣间质细胞以体外研究主动脉瓣钙化。J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们展示了使用两步胶原酶法从小鼠心脏中分离主动脉瓣间质细胞，并在少量生长培养基中进行后续培养的方法。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 成年小鼠瓣膜细胞分离前的准备

1. 使用70%（v/v）乙醇清洁并灭菌图1A所示的所有手术器械，随后高压灭菌30分钟。用70%乙醇清洁手术工作区。
2. 将500 µL青霉素-链霉素加入50 mL的10 mm HEPES中。准备50 mL的1×磷酸盐缓冲液（PBS）。将溶液置于冰上保存。
3. 配制1 mg/mL和4.5 mg/mL的胶原酶溶液，每种溶液各取5 mL分装至15 mL离心管中用于整个操作。配制5 mL的1 mg/mL胶原酶溶液时，将5 mg胶原酶与2.5 mL无胎牛血清（FBS-free）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）以及2.5 mL含抗生素（来自步骤1.2的1%青霉素-链霉素）的10 mM HEPES混合。通过0.22 µm滤器过滤溶液，以去除任何污染物。
   注意：将溶液置于冰上以保护酶活性。
4. 在后续所有步骤中使用前，将DMEM溶液预热至37 °C。通过向DMEM中添加1%青霉素-链霉素、1%丙酮酸钠、5 mL 200 mM L-谷氨酰胺、1 mL支原体清除试剂（见材料表）和10% FBS，配制完全培养基。

2. 瓣膜细胞的分离

1. 为获得实验所需的 10⁶ 个细胞，使用五只 8 周龄小鼠（最少三只）。将小鼠放入诱导室中，同时放入一小片浸有 1 mL 异氟烷的纸巾，但避免小鼠直接接触纸巾。通过脚趾夹捏反射确认动物已完全麻醉后，采用颈椎脱位法处死小鼠。在进行颈椎脱位前使用异氟烷以减轻疼痛，因为下述操作为终末性实验步骤。
2. 将小鼠置于解剖平台，用套管固定四肢以保持其位置。用乙醇清洁胸部和腹部；用剪刀剪开腹部和胸部。使用小型手术剪在左心房与左心室之间剪开，以使小鼠放血。用 10 mL 冷的 1× PBS 灌注心脏，以清除心脏中的血液。
3. 剪下心脏，并保留升主动脉起始处约 3 mm 的部分，如 图 1B 所示。在体视显微镜下分离主动脉瓣。在心室中部水平横向剪开心脏（图 1C）。从左心室向主动脉方向剪开，并仔细分离主动脉瓣（图 1D–F）。将分离的瓣膜组织集中放入一个小型 35 mm 组织培养皿中。
4. 在 75 mm 细胞培养皿中用 5 mL 冷 HEPES（10 mM）（含抗生素，1% 青霉素-链霉素）清洗分离的瓣膜，以去除残留血液（图 2）。按照上述 步骤 1.3 所述，准备两管分别为 1 mg/mL 和 4.5 mg/mL 的胶原酶溶液。
   注意：解剖完成后，应在无菌生物安全柜中操作分离的瓣膜，以尽量减少污染。
5. 将瓣膜在 I 型胶原酶（1 mg/mL）中于 37 °C 持续振荡孵育 30 分钟（图 2）。在 150 × g 条件下离心 5 分钟，弃上清，用 2 mL HEPES（10 mM）洗涤沉淀一次，并高速涡旋 30 秒。将管内内容物倒入 35 mm 培养皿中，用细镊子小心将组织碎片转移至新管中。
   注意： 此阶段心瓣膜间质细胞（VICs）尚未从组织中完全解离，沉淀中仍含有组织碎片。为避免内皮细胞污染，在 步骤 2.5 涡旋后不要再次离心。
6. 将沉淀物置于 15 mL 管中，加入 5 mL I 型胶原酶（4.5 mg/mL），于 37 °C 持续振荡条件下孵育 35 分钟。用 1 mL 移液器吹打重悬细胞以分离细胞，然后在 4 °C 下以 150 × g 离心 5 分钟。
7. 弃去上清液，将沉淀用 2 mL 完全 DMEM 培养基重悬，并在 4 °C 下以 150 × g 离心 5 分钟。重复此步骤两次以清洗细胞。
   注意： 沉淀中仍可能含有少量组织碎片。
8. 将沉淀用 1 mL 完全培养基重悬，并将细胞接种至 6 孔细胞培养板的一个孔中，使用最少体积的培养基以促进细胞贴壁。将细胞置于 37 °C、含 5% 二氧化碳的培养箱中，静置培养，避免扰动。
9. 3 天后，在显微镜下观察细胞，确认细胞在组织碎片周围生长良好。当显微镜下可见约 1,000 个细胞时，用经高压灭菌的镊子小心移除组织碎片，并更换培养基。
   注意： 培养板不应被扰动；若未观察到足够数量的细胞，应将细胞培养板放回培养箱继续培养 2 天。

结果

图 1：瓣膜解剖过程说明。 (A) 解剖所需全部手术器械的代表性图像，剪刀 2 用于切开小鼠皮肤，剪刀 3 用于打开胸腔。镊子 5 和 6 用于固定皮肤并打开胸腔。 (B) 在主动脉处保留 3 mm 的组织（黑色箭头）。 (C) 使用 4 号剪刀在心室中部剪开心脏。 (D<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3 mm 刃口剪刀	F.S.T	15000-00
Bonn 剪刀	F.S.T	14184-09
Ⅰ型胶原酶（125 单位/mg）	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Thermofisher	11965092
超细 Graefe 镊子	F.S.T	11150-10
FBS	Gibco 16000044
精细镊子	F.S.T Dumont
HEPES 1 M 溶液	STEMCELLS TECHNOLOGIES
L-谷氨酰胺 100x	Thermofisher Scientific	A2916801
Mycozap	Lanza	VZA-2011	支原体清除试剂
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
青霉素-链霉素 100x	Thermofisher Scientific	10378016
丙酮酸钠 100 mM	Thermofisher Scientific	11360070
标准齿纹镊子	F.S.T	11000-12
外科剪刀 - 尖头钝头	F.S.T	14008-14
0.05% 胰蛋白酶	Thermofisher Scientific	25300054