小鼠瓣膜间质细胞的分离：一种从鼠主动脉瓣分离和培养VIC的酶消化法

摘要

来源：Bouchareb, R. 等。分离小鼠主动脉瓣间质细胞以体外研究主动脉瓣钙化。J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们展示了使用两步胶原酶法从小鼠心脏中分离主动脉瓣间质细胞，并在少量生长培养基中进行后续培养的方法。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 成年小鼠瓣膜细胞分离前的准备

1. 使用70%（v/v）乙醇清洁并灭菌图1A所示的所有手术器械，随后高压灭菌30分钟。用70%乙醇清洁手术工作区。
2. 将500 µL青霉素-链霉素加入50 mL的10 mm HEPES中。准备50 mL的1×磷酸盐缓冲液（PBS）。将溶液置于冰上保存。
3. 配制1 mg/mL和4.5 mg/mL的胶原酶溶液，每种溶液各取5 mL分装至15 mL离心管中用于整个操作。配制5 mL的1 mg/mL胶原酶溶液时，将5 mg胶原酶与2.5 mL无胎牛血清（FBS-free）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）以及2.5 mL含抗生素（来自步骤1.2的1%青霉素-链霉素）的10 mM HEPES混合。通过0.22 µm滤器过滤溶液，以去除任何污染物。
   注意：将溶液置于冰上以保护酶活性。
4. 在后续所有步骤中使用前，将DMEM溶液预热至37 °C。通过向DMEM中添加1%青霉素-链霉素、1%丙酮酸钠、5 mL 200 mM L-谷氨酰胺、1 mL支原体清除试剂（见材料表）和10% FBS，配制完全培养基。
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结果

图 1：瓣膜解剖过程说明。 (A) 解剖所需全部手术器械的代表性图像，剪刀 2 用于切开小鼠皮肤，剪刀 3 用于打开胸腔。镊子 5 和 6 用于固定皮肤并打开胸腔。 (B) 在主动脉处保留 3 mm 的组织（黑色箭头）。 (C) 使用 4 号剪刀在心室中部剪开心脏。 (D<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3 mm 刃口剪刀	F.S.T	15000-00
Bonn 剪刀	F.S.T	14184-09
Ⅰ型胶原酶（125 单位/mg）	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Thermofisher	11965092
超细 Graefe 镊子	F.S.T	11150-10
FBS	Gibco 16000044
精细镊子	F.S.T Dumont
HEPES 1 M 溶液	STEMCELLS TECHNOLOGIES
L-谷氨酰胺 100x	Thermofisher Scientific	A2916801
Mycozap	Lanza	VZA-2011	支原体清除试剂
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
青霉素-链霉素 100x	Thermofisher Scientific	10378016
丙酮酸钠 100 mM	Thermofisher Scientific	11360070
标准齿纹镊子	F.S.T	11000-12
外科剪刀 - 尖头钝头	F.S.T	14008-14
0.05% 胰蛋白酶	Thermofisher Scientific	25300054