小鼠胚胎泌尿道亚甲蓝染料注射：一种评估泌尿道先天性梗阻的方法

摘要

来源：Yun, K. 通过亚甲蓝染料注射评估尿路连接处梗阻缺陷。 J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，我们向围产期胚胎小鼠的泌尿系统注射亚甲蓝染料，以评估与泌尿系统梗阻相关的先天性异常。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核

1. 亚甲蓝染料溶液的制备

1. 称取0.1 g亚甲蓝粉末。
2. 将亚甲蓝加入10 mL生理盐水或1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，通过涡旋充分溶解。
3. 使用注射器滤器（膜孔径0.45 µm）过滤10 mg/mL的亚甲蓝溶液，以防止注射时发生堵塞。
4. 将无菌头皮静脉输液套件（27 G × 3/4″）与一支3 mL一次性注射器组装，并用3 mL过滤后的亚甲蓝溶液充满注射器。
   注意：为防止静水压力导致染料自行流出，应将针尖置于盛有亚甲蓝溶液的注射器上方。

2. 产前胚胎的解剖

1. 用70%乙醇清洁解剖剪和镊子。
2. 为在E18.5或E19.5收集围产期胚胎，首先使用CO₂吸入法对怀孕小鼠实施安乐死，然后根据NIH指南进行颈椎脱位。
   注意：怀孕雌性小鼠通常从E18.5开始分娩，但较大的肾脏更易于操作。因此，接近出生时间的E19.5肾脏更便于进行本项分析。然而，双侧尿路梗阻的仔鼠在出生后会死亡。应根据实验小鼠的具体特征，通过实验经验确定合适的采集日期/时间。
3. 在腹部腹侧表面喷洒70%乙醇，然后使用解剖剪和镊子沿腹侧打开腹腔。
4. 提起整个子宫，并用解剖剪在子宫角末端处剪断，将其从体内分离。
5. 在培养皿中用1×PBS冲洗整个子宫。
6. 用解剖剪将子宫分段剪开，并用解剖镊子去除胎盘蜕膜，以暴露卵黄囊中的胚胎。
7. 先去除卵黄囊，再用解剖镊子去除羊膜，从而释放出围产期胚胎。
8. 用解剖剪将胚胎头部剪除。用无菌纱布擦去多余血液。将胚胎腹面朝上固定于配备数码相机的解剖显微镜下进行成像。如有必要，取其尾部用于基因型鉴定。
   注意：应逐个胚胎进行注射操作。
9. 用镊子小心撕开胚胎皮肤，打开其腹腔。然后，用镊子小心剪除或拉出肝脏、胃和肠道等多余器官和组织，以暴露位于背部的肾脏、输尿管和膀胱（图1A）。如有必要，用无菌纱布吸去解剖后胚胎上的多余血液。
   注意：过多血液会影响肾盂的识别，从而干扰染料注射。

3. 向肾盂注射亚甲蓝染料并监测染料流动

1. 通过静水压力将亚甲蓝溶液从针尖排出，以去除针头和管路中的气泡。将装有染料溶液的注射器抬高至针尖水平以上以启动液体流动，然后降低注射器以停止流动。
2. 将针头插入近端输尿管附近的肾盂，注意一旦放置到位后避免扰动。向肾脏注射染料以确定其尿路是否发生梗阻。
   注意：应首先以相同方式对任何异常肾脏进行染料注射，以确定其尿路梗阻情况。
3. 将注射器抬高约 20 cm 以提供静水压力，使 15 µL–60 µL 的染料溶液流出。若将注射器抬高至此高度，则流速约为 3 µL/s。
4. 观察染料的蓝色显色过程：首先出现在肾盂，随后沿输尿管延伸，最终进入膀胱腔。
   注意：若输尿管正确插入膀胱，则约 5 秒内可见膀胱腔内出现微弱的染料着色。若膀胱腔内未见染料着色，应让染料在阻塞部位积聚约 15 秒。
5. 放下注射器以停止染料流动，并将针头从肾脏中取出。
6. 使用连接体视显微镜的相机和成像程序，拍摄被染料标记的肾脏、输尿管和膀胱的图像。
7. 在实验记录本中记录肾脏的肾积水情况、输尿管扩张程度以及染料溶液的最终分布位置。
8. 按照 步骤 3.1 至 3.5 对对侧肾脏进行注射，总染料流动时间约为 20 秒。
   注意：若输尿管正确插入膀胱腔，膀胱腔将充满染料溶液，表现为明显的蓝色。完成尿路连接部梗阻评估后，可将输尿管和膀胱固定，用于后续切片处理。

结果

图1. 亚甲蓝染料注入正常泌尿系统的示例。（A） 围产期胚胎（E19.5）去除多余组织后泌尿系统的典型图像。可见两个肾脏、两条输尿管和一个膀胱，并伴有生殖器官，此处为睾丸 （B） 向正常肾脏注入染料的示例。可见向肾脏肾盂注射的位点（黑色箭头）。让染料流动5秒后，输尿管和膀胱腔内可见浅色染料。 （C） 向两个正常肾脏注射染料后膀胱腔内的染料积聚。让染料流动20秒后，由于染料溶液在膀胱腔内积聚，颜色明显加深。肾脏中亦可见肾盂呈现浅色染料。B：膀胱，K：肾脏，T：睾丸，U：输尿管。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
亚甲蓝	Sigma-Aldrich	M9140
Quality Biological Inc. 生理盐水 - 500 mL	Fisherscientific	50-983-204
带 BD Luer-Lok 接头的 3 mL 一次性注射器	BD	309657
带 Supor 膜的 Acrodisc 注射器滤器	Pall corporation	4614
Exel 头皮静脉（蝴蝶型）穿刺针；27G x 3/4" 12"	EXELINT	26709
精细手术剪	Roboz 外科器械公司	RS-6702
显微解剖镊	Roboz 外科器械公司	RS-5135
Dumont 镊子；型号 #5	Roboz 外科器械公司	RS-5045
BD PrecisionGlide 针头 30G x 1/2"	BD	305106